高效液相色谱法测定通经甘露丸中大黄酸、大黄素及大黄酚含量

吴 袭

(湖南省怀化市第一人民医院，湖南 怀化 418000)

通经甘露丸收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂(第一册)》，是由当归、桃仁、红花、牡丹皮、牛膝、大黄等10味中药制成的水丸，具有活血祛瘀、通经止痛功效，用于血瘀阻滞所致经闭不通、小腹疼痛，或经量少、小腹疼痛拒按。原质量标准中无含量测定项，为有效控制药品质量，确保疗效，笔者参考文献[1]，采用高效液相色谱法测定其大黄中大黄酸、大黄素及大黄酚含量。

1 仪器与试药

LC-10ATVP型高效液相色谱仪，SPD-10AVP紫外检测器(日本岛津);AB135-S型电子天平(瑞士梅特勒);AEU-210型电子天平(湘仪集团)。大黄酸、大黄素及大黄酚对照品均为中国药品生物制品检定所提供(批号分别为0757-200206，0756-200110及0756-200329);通经甘露丸(吉林省柳河辉发制药股份有限公司，批号分别为 20080301，20071101，20080615，规格为 6 g/100 粒);甲醇、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液(85 ∶15);流速:1.0 mL/min;检测波长:254 nm。在此色谱条件下，大黄酸、大黄素、大黄酚色谱峰与样品中其他组分峰能达基线分离，且与其他相邻峰的分离度均大于1.5，理论板数按大黄素峰计应不低于7 000，缺大黄的阴性对照品溶液色谱在与大黄酸、大黄素及大黄酚对照品溶液色谱峰相应位置上无干扰峰(图1)。

2.2 溶液制备[2]

精密称取经五氧化二磷减压干燥16 h的对照品大黄酸7.70 mg、大黄素4.80 mg及大黄酚7.76 mg，分别置100 mL量瓶中，用乙酸乙酯-无水乙醇(1∶2)混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取大黄酸对照品贮备液2 mL、大黄素对照品贮备液2 mL及大黄酚对照品贮备液3 mL，置同一10 mL量瓶中，加上述混合溶液至刻度，摇匀，制成1 mL中含大黄酸 15.40μg，大黄素9.60μg，大黄酚 23.28μg的混合对照品溶液。取本品适量，研细，取约1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，冷却，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取5 mL，置锥形瓶中，蒸干，残渣加盐酸溶液(1→10)10 mL，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)5 min，再加三氯甲烷10 mL，置水浴上加热回流1 h，立即冷却，移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，酸液再用三氯甲烷提取2次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，回收三氯甲烷液至干，残渣用乙酸乙酯-无水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，溶液转移至10 mL量瓶中并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。取缺大黄的阴性样品适量，照供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察:精密吸取上述混合对照品溶液6，8，10，12，14，16μL，进样测定其峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标、进样量为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程分别为大黄酸 Y=1 479 587 X+1 239，r=0.999 8(n=6);大黄素 Y=2 589 583X-7.3，r=0.999 9(n=6);大黄酚 Y=3 892 899X+58.5，r=0.999 8(n=6)。结果表明，大黄酸进样量在0.092 4～0.2464μg，大黄素进样量在0.0576～0.153 6μg，大黄酚进样量在0.139 7～0.372 5μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:精密吸取对照品溶液10μL，重复进样5次，测定大黄酸、大黄素及大黄酚峰面积积分值，结果的 RSD分别为1.02%，1.25%，0.64%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，于0，2，4，8，10 h时分别进样1次，依法测定大黄酸、大黄素及大黄酚的峰面积积分值。结果的RSD分别为0.98%，1.10%，1.03%(n=5)，表明供试品溶液在10 h内较稳定。

重复性试验:取同一批(批号为20080301)样品，分别取样5份，依法测定大黄酸、大黄素及大黄酚的含量。结果的 RSD分别为1.18%，0.83%，1.07%(n=5)，表明本法重复性较好。

加样回收试验:取已知含量(每克含大黄酸0.655 7 mg，大黄素0.327 5 mg，大黄酚 1.265 2 mg)的样品，研细，取约 0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，冷却，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取5 mL，精密加入混合对照品溶液(大黄酸0.065 4 g/L，大黄素0.033 8 g/L，大黄酚 0.120 1 g/L)0.8，1.0，1.2 mL，按供试品溶液制备方法制备溶液，并测定其含量，结果见表1。

表1 加样回收试验测定结果(n=6)

2.4 样品含量测定

取样品3批，按供试品溶液制备方法制备供试液并测定峰面积，计算样品中大黄酸、大黄素及大黄酚的总量。结果批号为20080301，20071101，20080615的3批样品中，大黄酸、大黄素及大黄酚的含量分别为 1.248 4，1.199 6，1.305 7 mg/g。

3 讨论

经紫外-可见分光光度计扫描，大黄酸、大黄素和大黄酚在254 nm波长处有最大吸收，且灵敏度高，故选254 nm作为检测波长[3]。曾比较了三氯甲烷和乙醚的提取效果，结果三氯甲烷提取的大黄酸、大黄素和大黄酚含量远远高于乙醚，故用三氯甲烷作为提取溶剂[3]。提取2次和提取3次对含量无明显影响，故决定提取2次。所建立的高效液相色谱法操作简便，结果准确，重现性好，且样品分离效果好，用于通经甘露丸中大黄酸、大黄素和大黄酚的含量测定，能有效控制通经甘露丸的质量。

[1]WS3-B-0121-89，中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂(第一册)[S].

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2005:373，649.

[3]刘 译.RP-HPLC法测定牛黄至宝丸中大黄素和大黄酚的含量研究[J]. 中医药导报，2007，13(8):83-84.