聚乙烯亚胺介导基因转染的影响因素研究

周 鹏，张 瑜

(1.广东省深圳龙珠医院，广东 深圳 518055;2.新疆维吾尔自治区人民医院高血压科，新疆 乌鲁木齐 830001)

基因转染是指利用基因载体携带目的基因运送到细胞内的方法。目前在基因治疗中，由于病毒载体存在着诸多缺陷[1]，非病毒载体如阳离子脂质体和阳离子共聚物越来越受到重视[2-3]。其中聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是目前研究较多的聚阳离子型基因载体[4]，富含氨基，可与DNA链上负电性的磷酸根通过静电作用缔合成复合物。在此过程中，DNA会被高度压缩成50～200 nm大小的纳米球[5]，大大增强了对细胞膜的穿透作用，因此具有较高的转染效率[6]。但PEI作为非病毒基因载体，其转染效率的影响因素较多，重复性不好。笔者考察了影响其转染效率的因素，从而筛选出较优的转染条件，为进一步的研究打下基础。

1 实验材料

PEI(相对分子质量为25 000，支链型，无水，Aldrich-Sigma公司)。人宫颈癌细胞系Hela细胞(ATCCNo.CCL-2.1)，在100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，血清56℃灭活30 min。真核表达质粒编码增强型绿色荧光蛋白(theenhanced green fluorescent protein，pEGFP-C1，华西医科大学惠赠)，由CMV启动子驱动，在DH5α菌株中大量扩增。由QIAGEN公司的质粒大抽提试剂及纯化柱制备质粒，酶切鉴定。

2 方法与结果

2.1 PEI/DNA复合物的制备及其形态观察

氮磷比(N/P)为聚合物中的氨基基团与DNA中的磷酸基团的物质的量之比。根据N/P，将聚合物的磷酸盐缓冲液与质粒DNA的磷酸盐缓冲液混合，涡旋，室温静置30 min，获得聚合物-DNA复合物。取适量滴加在铜网上，用醋酸铀进行负染，干燥后置透射电镜下观察复合物胶束的形态。由图1可见，各PEI-DNA复合物纳米粒呈规则的球形，粒子大小分布较均一，表明二者已形成复合物纳米粒。

2.2 质粒量对转染效率的影响

图1 PEI-DNA纳米复合物的透射电镜图谱(N/P=20)

将Hela细胞接种到12孔板上，每孔1.5×105个细胞，培养24h，细胞汇合度不低于70%，将PEI与DNA分别在磷酸盐缓冲液中配成一定浓度的溶液。设质粒剂量分别为每孔 0.5，1，2，3，4 μg，然后将两者按N/P=10混合，涡旋，室温静置20 min。转染前吸去细胞培养液，加入不含血清的RPMI 1640培养液1 mL，再每孔加入100～200μL的PEI-DNA复合物，细胞培养箱中培养4 h后，吸去转染复合物，加入新鲜的含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养40～48 h，然后用磷酸盐缓冲液冲洗，再用0.25 g/L胰酶-乙二胺四乙酸消化液将细胞消化下来，用磷酸盐缓冲液重悬细胞，转染率通过在流式细胞仪上测定每10 000个细胞中发荧光的细胞百分数获得。结果如图2所示，在12孔板中，当每孔质粒量少于2μg时，转染率较低;当质粒量达到每孔2μg后，继续增加质粒量，转染率反而下降。因此12孔板质粒的用量以每孔2μg较适宜。

图2 不同质粒量对转染率的影响

2.3 复合物形成时间对转染效率的影响

将Hela细胞接种到12孔板上，每孔1.5×105个细胞，培养24h，细胞汇合度不低于70%，将PEI与DNA分别在磷酸盐缓冲液中配成一定浓度的溶液，按转染质粒量为每孔2μg，N/P=10混合，涡旋，室温静置 10，20，30，40，50 min。转染前吸去细胞培养液，加入不含血清的RPMI 1640培养液1 mL，再每孔加入100～200μL的PEI-DNA复合物，细胞培养箱中培养4 h后，吸去转染复合物，加入新鲜的含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养40～48 h，收集细胞，转染率通过在流式细胞仪上测定每10 000个细胞中发荧光的细胞百分数获得。复合物形成时间是PEI上的正电荷与DNA上负电荷相互作用形成球状纳米粒的时间，时间过短不能充分形成球状纳米粒，时间过长纳米粒容易沉淀影响转染效率。由图3可见，复合物形成时间以30 min为宜。

图3 复合物形成时间对转染率的影响

2.4 复合物与细胞作用时间对转染率的影响

将Hela细胞接种到12孔板上，每孔1.5×105个细胞，培养24 h，细胞汇合度不低于70%，将PEI与DNA分别在磷酸盐缓冲液中配成一定浓度的溶液，按转染质粒量为每孔2μg，N/P=10混合，室温静置30 min，转染前吸去细胞培养液，加入不含血清的RPMI 1640培养液1 mL，再每孔加入100～200μL的PEI-DNA复合物，细胞培养箱中培养3，4，5，6 h后，吸去转染复合物，加入新鲜的含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养40～48 h，收集细胞，转染率通过在流式细胞仪上测定每10 000个细胞中发荧光的细胞百分数获得。转染复合物需与细胞作用一定时间，使其与细胞充分接触，进入细胞内，但复合物作用时间较长时，细胞死亡较多，对转染不利。由图4可见，转染复合物与细胞作用4 h时转染效率较高。

图4 复合物在细胞上的作用时间对转染率的影响

2.5 N/P对转染效率的影响

将Hela细胞接种到12孔板上，每孔1.5×105个细胞，培养24 h，细胞汇合度不低于70%，将PEI与DNA分别在磷酸盐缓冲液中配成一定浓度的溶液，按转染质粒量为每孔2μg，N/P=10，15，20，25，30 混合，室温静置 30 min，转染前吸去细胞培养液，加入不含血清的RPMI 1640培养液1 mL，再每孔加入100～200μL的PEI-DNA复合物，细胞培养箱中培养4 h后，吸去转染复合物，加入新鲜的含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养40～48 h，收集细胞，转染率通过在流式细胞仪上测定每10 000个细胞中发荧光的细胞百分数获得。PEI介导的基因转染率与N/P比值的关系极大。笔者考察了N/P为 10，15，20，25，30 时对 PEI转染Hela的影响。如图5所示，N/P=20时被转染细胞增强型绿色荧光蛋白(EGFP)阳性效率最高。

图5 不同N/P对转染率的影响

3 讨论

PEI是目前研究较为广泛的聚阳离子基因载体，其每3个基团含有1个氨基，有丰富的阳离子电荷，可缩合DNA呈颗粒状。PEI-DNA复合物通过静电作用吸附到细胞表面[7]，被动内吞，进入细胞内。制备PEI-DNA复合物方法简单，转染效率不亚于各种商业化的体外转染剂[8]。PEI可作为一种结合DNA的骨架，偶联上导向配体、核定位信号肽等，合成更复杂的DNA非病毒载体释放系统，用于体内基因治疗。但影响PEI转染效率的因素较多，如质粒量、复合物形成时间、转染复合物与细胞作用时间、N/P等。其中N/P对转染的影响最大，N/P增加时，阳性细胞比例增加，细胞毒性也增加，根本原因在于PEI的用量增加。本试验发现，当N/P较低时，PEI-DNA复合物的转染效率随N/P增加而增加，当N/P增加到一定值后，细胞毒性增加明显，死亡细胞急剧增加，转染效率反而下降。

由本研究结果可知，PEI介导的基因转染Hela细胞较优的转染条件为质粒量2μg，复合物形成时间30 min，复合物在细胞上作用4 h，N/P=20。此转染条件可为进一步的体内研究打下基础。

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