巴戟天药材高效液相色谱指纹图谱初步研究*

程学仁，罗文汇，孙冬梅，崔景朝

(广东省中医研究所，广东 广州 510095)

2005年版《中国药典(一部)》中收载的巴戟天为茜草科植物巴戟天 Morinda officinalis How的干燥根。近代巴戟天的主流商品产于广东的高要、德兴及广西苍梧等地，《药物出产辨》中谓产于以上地区的巴戟天可视为晚近药用巴戟天的“新兴品种”[1]。近几年，指纹图谱技术被用于中药的质量控制，其优点是在大多数中药有效成分尚不明确的情况下，能全面反映中药复杂的化学成分和相对比例，有效地表征中药质量。笔者按照国家药品监督管理局《关于“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)”的通知》要求[2]，参照相关文献[3-6]，采用高效液相色谱法对巴戟天药材进行了指纹图谱研究，报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国惠普公司);二极管阵列检测器;电子分析天平(Sartorius)。巴戟天对照药材(编号为S1，中国药品生物制品检定所，批号为121163-200402);巴戟天药材采自中国广东、广西、江西等地和越南，经本所范宋玲主任中药师鉴定为茜草科植物巴戟天 Morinda officinalis How，药用部分为根，样品来源详见表1。液相用甲醇为进口色谱纯，水为注射用水;提取用水为反渗透水;其他试剂均为国产分析纯。

表1 巴戟天药材来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液系统，梯度洗脱，0～5 min甲醇50%，5～17 min甲醇 50% ～58%，35～55 min，甲醇 58% ～80%;柱温:40℃;流速:0.8 mL/min;检测波长:250 nm。

2.2 溶液制备

取巴戟天药材约1 g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷60 mL，回流3 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解并定容至2 mL，用0.45μm微孔滤膜滤过，摇匀，即得供试品溶液。取巴戟天对照药材约1 g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷60 mL，同法制成对照药材溶液。

2.3 方法学考察

精密度试验:取对照药材溶液连续进样6次，测定色谱指纹图谱。计算得图谱的相似度均大于0.98，各共有峰面积的 RSD小于0.60%，结果表明进样的精密度良好。

重复性试验:取4号样品，按2.2项下制备方法制备供试品溶液，进样，测定色谱指纹图谱。计算得图谱的相似度均大于0.97，各共有峰面积的 RSD小于0.75%，结果表明方法重复性良好。

稳定性试验:取4号样品制备的供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h时进样，测定色谱指纹图谱。计算得图谱的相似度均大于0.96，各共有峰面积的 RSD小于1.43%，表明供试品溶液至少在24 h内稳定。

2.4 HPLC指纹图谱分析与评价

图谱制备:详细比较10批巴戟天药材的液相色谱图，确定12个特征峰构成巴戟天的指纹图谱，各特征峰峰号及保留时间见表2。代表性指纹图谱见图1。

表2 10批巴戟天药材指纹图谱共有峰及保留时间

图1 巴戟天药材指纹图谱共有峰

共有峰相似性评价:根据巴戟天药材的高效液相色谱指纹图谱确定共有峰23个，并对共有峰的相对峰面积比值进行考察。由于HPLC峰的绝对迁移时间变化较大，所以采用相对迁移时间对色谱峰进行鉴别。经多次试验，选择5号峰作为参比内标较为合适。相对迁移时间 αi=ti/ts，ti为样品峰的迁移时间，ts为内标峰的迁移时间。相对迁移时间 αi从小到大排列，相对迁移时间 αi下面列出了相对峰面积 βi。相对峰面积 βi=Ai/As，Ai为样品峰面积，As内标峰面积。结果见表3。可见，共有峰相对保留时间的 RSD小于1.94%;10批样共有峰总面积占总峰面积的94.38%，非共有峰总面积均小于总峰面积的10%。

指纹图谱相似度计算:采用《中国药典》指纹图谱相似度评价系统(A版)，对10批巴戟天药材进行相似度评价。将10批药材指纹图谱导入相似度评价软件，设定匹配模板，进行谱峰自动匹配，生成对照指纹图谱，进行相似度评价。由表4可见，药材与对照药材图谱的相似度(以平均数计算和以中位数计算)均大于0.9，表明10批药材与对照药材指纹图谱相似度良好。

表3 巴戟天药材高效液相色谱指纹图谱的共有峰相对保留时间的相对峰面积(βi，n=4)

表4 10批巴戟天药材相似度计算结果

3 讨论

采用正交设计法对巴戟天的最佳提取条件进行筛选，其中对提取溶剂(甲醇、乙醇、乙酸乙酯和三氯甲烷)、提取时间、提取次数进行考察，采用HPLC进行测定，在综合考虑峰面积较大、峰个数较多等几个方面的因素后，确定2.2项中的提取条件为最佳提取条件。采用二极管阵列检测器对指纹图谱的检测波长进行选择，比较了不同波长下的色谱图，基于峰面积较大、峰个数较多、分离度较好、峰形较好、基线较平稳等多方面的考虑，最后选择250nm作为最佳检测波长。对巴戟天供试品溶液进行了甲醇-水和乙腈-水流动相系统考察，经过分离效果的反复摸索，发现甲醇-水系统基线较乙腈-水系统平直，流动相中加入磷酸后改善了色谱峰的峰形和分离度。本研究建立的巴戟天药材指纹图谱方法具有很好的稳定性、重现性，相似度计算在宏观上能总体反映出巴戟天的化学特征，为规范巴戟天药材的质量提供了依据。在本研究中，虽然收集了10个巴戟天药材，采用HPLC法作为获得化学数据的手段，进行了巴戟天的指纹图谱研究，但所获得的信息也只能从一个侧面反映巴戟天药材的质量。为了获得更全面的分类信息，使巴戟天药材质量的评价方法更为完善，还需要收集更多的样品进行比较分析。

[1]唐肖洪.巴戟天的研究进展[J].中国现代中药，2006，8(11):29-30，33.

[2]国家药品监督管理局.中药注射液指纹图谱研究的技术要求(暂行)[J]. 中成药，2000，22(10):671-675.

[3]屠鹏飞.高效液相色谱法制定中药材和中药注射剂特征指纹图谱的探讨[J]. 中成药，2000，22(7):516.

[4]仰铁锤，徐吉银，梁英娇，等.HPLC测定巴戟天中的水晶兰苷[J].华西药学杂志，2008，23(6):695-696.

[5]梁英娇，徐吉银，丁 平.巴戟天不同部位及混伪品中水晶兰苷的含量测定[J]，中药新药与临床药理，2008，19(1):48-50.

[6]洪筱坤，王智华.中药数字化色谱指纹图谱[M].上海:上海科学技术出版社，2003:108.