从植物乳杆菌全细胞转化液中分离纯化γ-氨基丁酸的工艺研究*

张术聪，刘婷婷，杨套伟，夏海锋，饶志明

(江南大学工业生物技术教育部重点实验室江南大学生物工程学院，江苏无锡，214122)

从植物乳杆菌全细胞转化液中分离纯化γ-氨基丁酸的工艺研究*

张术聪，刘婷婷，杨套伟，夏海锋，饶志明

(江南大学工业生物技术教育部重点实验室江南大学生物工程学院，江苏无锡，214122)

前期筛选获得1株高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸(GABA)的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GB01－21，该菌以浓度200g/L的L-谷氨酸为底物，发酵20 h左右，能以99%的摩尔转化率生产γ-氨基丁酸，产物γ-氨基丁酸的终浓度可达140g/L左右。从全细胞转化液中分离纯化γ-氨基丁酸，着重对脱色工艺进行了研究，考察了温度、时间、pH和活性炭添加量对脱色效果的影响。通过单因素实验的基础上的正交实验分析，确定了脱色最佳工艺条件为粉末活性炭(150～200目)用量为1.5%，脱色温度70℃，pH值4.0，脱色时间40 min，γ-氨基丁酸转化液的脱色率高达98.42%，γ-氨基丁酸的保留率可达97.23%。随后对γ-氨基丁酸转化液进行初步分离纯化，最终测得γ-氨基丁酸的回收率89.4%，纯度为96.7%。

γ-氨基丁酸，全细胞转化，脱色，分离纯化

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，GABA)是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，广泛存在于动物、植物和微生物中，具有降低血压、促进生殖、活化肝肾等多种生理功能，在食品及医药方面具有广泛的应用前景［1］。生物发酵法合成γ-氨基丁酸具有条件温和，对环境友好等特点，已受到国内外研究学者的广泛重视［2］，但其发酵液是个极其复杂的多相体系，含有微生物细胞、代谢产物以及未耗尽的培养基等，给GABA的下游分离纯化带来一定困难，这也成为目前工业化生产GABA的瓶颈问题。

目前，只有日本实现了生物合成GABA的工业化生产，国内虽有多家研究机构对发酵法制备GABA技术进行研究，但GABA提取效率或纯度比较低，而且成本较高［3－5］。由此可见，如何低成本、高效率地对GABA纯化提取已成为工业化生产γ-氨基丁酸的关键因素。本实验室前期筛选出1株高产GABA的菌株——植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GB01－21，利用全细胞转化法生产GABA，摩尔转化率可达99%(已申请国家发明专利，申请号为200910183478.1)，且转化液成分较为单一，有效避免了由发酵液成分复杂给下游提取造成的不利影响，但同时也存在转化液颜色较深等问题。本研究主要对转化液脱色工艺条件进行了研究，并在脱色的基础上对γ-氨基丁酸进一步分离提取，从而获得了高回收率、高纯度的γ-氨基丁酸，为工业化生产打下基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GB01－21，实验室保存。

1.2 培养基［6－7］

活化培养基(g/L):酪蛋白胨10，牛肉提取物10，酵母提取物5，葡萄糖5，乙酸钠5，柠檬酸二胺0.2，吐温－80 0.1，K2HPO40.2，MgSO40.2，MnSO40.05，CaCO320，pH 值6.5，0.08 MPa 灭菌15 min。

种子培养基(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，葡萄糖10，丁二酸钠5，pH 6.5，0.08 MPa 灭菌 15 min。

1.3 主要试剂和仪器

GABA标准品(Sigma公司)，丹磺酰氯(Dns-Cl)、活性炭颗粒炭A、颗粒炭 B、粉末炭 C，NaHCO3、L-谷氨酸(L-Glu)、无水乙醇、冰乙酸、乙酸钠(均为国药分析纯);实验用水为去离子水。

PHS-3C型精密 pH计，Mettler公司;UltiMate-3000型高效液相色谱仪，戴安公司;UV-2000紫外-可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;电热恒温水浴锅，江苏金坛市环宇科学仪器厂;旋转蒸发仪，上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 分离工艺流程

GABA分离纯化的工艺流程为［8］:

1.4.2 菌体培养

将斜面保藏的菌种接种至活化培养基中，30℃、160 r/min振荡培养24 h，再以2%的接种量接入种子培养基，30℃、160 r/min振荡培养24 h。

1.4.3 转化液的制备

离心收集菌体，用双蒸水洗涤菌体3次，最后用3 L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.8，0.1mol/L)悬浮菌体，加入200 g L-Glu，30℃下，在5L发酵罐中转化24 h。

1.4.4 转化液预处理

收集转化液，离心取上清，在70～80℃加热30 min，经单层滤纸过滤后再用0.45 μm滤膜进行抽滤，收集滤液4℃保藏备用。

1.4.5 活性炭预处理［9］

试验用活性炭经验，热去离子水洗，滤干、干燥(120℃干燥6～8 h)，冷却到室温备用。

1.4.6 真空抽滤及结晶

活性炭脱色后，经双层滤纸过滤后用0.45 μm滤膜进行抽滤，收集滤液于55℃进行真空浓缩至稀稠状，加入3倍体积的95%的乙醇结晶，4℃下静置12 h，过滤收集晶体。

1.5 测定方法

1.5.1 GABA和L-Glu 的测定方法［10－11］

采用HPLC法测定GABA及L-Glu:Agilent TC C18柱(250 mm ×4.6 mm);进样量:10μL;紫外检测波长:254 nm;柱温:室温;流动相A:甲醇;流动相B:四氢呋喃-甲醇-0.05mol/L醋酸钠(pH值6.2)(体积比为5∶75∶20);洗脱方式:线性梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.5.2 样品和标准品柱前衍生反应

取样品0.1mL，加入0.2mol/L pH值9.8的NaHCO30.9mL，再加入等量的Dns-Cl丙酮(2g/L)溶液，避光，置于30℃下衍生1 h。

1.5.3 转化液中色素吸收波长的测定

量取一定量转化液，以该溶液中色素浓度为100%，稀释不同倍数，配成一定浓度梯度的标准溶液，以去离子水为空白，测量其在450 nm波长下溶液的吸光度，平行3次。

1.5.4 转化液脱色

选取温度、时间、pH值和活性炭添加量4个因素，对转化液进行脱色实验，过滤，滤液在450 nm下测定吸光值，计算脱色率［12］:

式中:Ds为脱色率;A0为脱色前样液的吸光度值;A为脱色后样液的吸光度值

GABA保留率的计算公式:

式中:Dx为GABA保留率，%;C0为脱色前GABA质量浓度，g/L;C为脱色后的GABA质量浓度，g/L。

2 结果与讨论

2.1 转化液中GABA和L-Glu的测定

按照方法1.4.3进行全细胞转化制备转化液，对转化液进行衍生化，用HPLC进行检测，结果见图1。

图1 GABA、L-Glu以及转化液HPLC检测图

用HPLC测得转化液中GABA的含量为139.2 g，摩尔转化率为99.3%;由图1也可以看出，转化液中L-Glu几乎检测不到，因此可以确定本实验中下一步分离纯化过程不需要考虑L-Glu与GABA的分离，减少了繁琐的离子交换［13］等分离步骤，节约了成本。

2.2 转化液中色素吸收波长的测定

对转化液进行全波长扫描，扫描结果表明GABA转化液无最大吸收波长，根据文献［14］，GABA转化液中的色素吸收峰应在400～500 nm，按照1.5.3方法对转化液中色素吸收波长的进行了测定，结果如图2所示。

由图2可知，在450 nm下转化液浓度与吸光度A的相关系数较高，相关性较好，所以选择450 nm作为检测波长。

图2 色素浓度与吸光度(A)的关系

2.3 活性炭的选择

实验中发现，不同颗粒大小的活性炭对预处理转化液脱色效果差异很大，分别选择不同颗粒大小的活性炭颗粒炭A，颗粒炭B，粉末炭C在相同的条件下对转化液进行脱色效果比较，结果见表2。

表2 不同颗粒大小的活性炭对脱色率的影响

由表2可知，粉末状活性炭C的脱色效果十分显著，经处理后溶液清澈透明，脱色率达到91.2%。因此，选用粉末状活性炭C作为脱色用炭。

2.4 活性炭脱色条件研究

2.4.1 单因素实验确定脱色条件

按照工业上活性炭用量不超过3%的原则，选取温度、时间、pH值和活性炭添加量4个因素，对转化液进行脱色实验，过滤，滤液在450 nm下测定吸光值，计算其脱色率、GABA保留率。

活性炭用量对转化液的脱色效果影响较大(如图3)，随着活性炭用量的增加脱色效果越来越好，但当活性炭用量超过2.0%时，脱色率增加的幅度比较小，而GABA的损失率却继续增加。由实验结果确定选用2.0%作为最佳活性炭脱色浓度，该用量明显低于工业应用中活性炭用量不超过3%的要求。

图3 活性炭用量对脱色效果的影响

转化液的脱色效果随着脱色时间的增加而越来越好(如图4)，在超过30 min后，脱色率的变化幅度不大，而GABA的保留率随着时间的延长却越来越小，综合考虑选择脱色时间为30 min。

图4 脱色时间对活性炭脱色效果的影响

温度对活性炭脱色效果影响较大(如图5)。由图5可以看出，随着脱色温度的升高，脱色率升高，GABA保留率则降低，温度从30℃升到60℃时，脱色率变化显著，保留率降低的也较快，温度升至60℃后，预处理液脱色率变化不明显，而保留率也继续降低，因此确定脱色温度为60℃。

图5 温度对活性炭脱色效果的影响

转化液的pH值对活性炭脱色效果有一定的影响(见图6)，在pH值为5.0时，脱色率达到最大为93.3%，此时GABA的保留率也较高为89.3%，所以选择脱色pH值为5.0。

图6 pH值对活性炭脱色效果的影响

2.4.2 正交设计确定活性炭脱色最佳工艺条件

根据单因素实验结果，选择四因素三水平，按L9(43)进行正交实验，见表3，以确定最佳的活性炭脱色工艺条件。

表3 活性炭脱色因素水平表

以预处理转化液的脱色率、保留率为指标，进行正交试验，确定活性炭脱色的最佳工艺条件，具体的试验结果见表4。

表4 活性炭脱色正交试验设计及结果

由表4分析得知，影响活性炭脱色效果的因素中，按影响程度的大小顺序为B＞D＞C＞A。最佳的工艺条件为A2B3C3D2;而在脱色过程中对GABA的保留率的影响因素顺序为A＞D＞C＞B，依次为pH值、时间、活性炭添加量和温度，最佳工艺条件为A1B3C1D2。综合考虑脱色率和GABA的保留率，最终确定工艺条件为A1B3C1D2，即在70℃下、调节pH值为4.0、添加1.5%的活性炭、脱色40 min。在最佳工艺条件下进行了脱色的效果试验，脱色率为98.42%，GABA的保留率为97.23%。

2.5 转化液中GABA分离纯化及产品质量评价

按照方法1.4.3进行全细胞转化制备的转化液，用HPLC测其中GABA的含量为139.2 g，按上述脱色条件进行进行脱色后，旋转蒸发浓缩至稀糊状，加入3倍体积的95%乙醇静置12 h，过滤干燥后得到128.7gGABA成品，用氨基酸自动分析仪分析(图7)，产品纯度可达96.7%，整个工艺GABA的回收率为89.4%。

图7 GABA成品氨基酸自动分析仪分析图谱

3 结论

目前，以生物合成法生产GABA，由于下游分离提取困难，已成为微生物法工业化生产GABA的主要制约因素，因此GABA的分离提取工艺已成为研究热点。王文等［3］采用高速离心、超滤和稀释过滤相结合的方法，将GABA的回收率由原来的50%提高到将近95%，但 GABA的纯度仍然较低，仅为31.63%。王兢［4］采用NKA-9大孔吸附树脂和阴离子交换树脂D201对乳酸菌SK005发酵生产GABA的发酵液进行脱色纯化处理，产品的纯度达到了90.8%，但收率不高。本研究小组前期利用高转化率的植物乳杆菌全细胞转化法生产GABA，避免了发酵液成分复杂给下游提取造成的不利影响，但同时也存在转化液颜色较深等问题，因此本研究对转化液脱色工艺条件进行了研究。确定了活性炭脱色的最佳工艺条件:活性炭用量1.5%，脱色温度70℃，pH值4.0，脱色时间40 min，GABA转化液的脱色率高达98.42%，GABA的保留率可达97.23%。运用此工艺对GABA转化液进行进一步分离纯化，GABA的回收率为89.4%，纯度为96.7%，回收率和纯度在国内均处于领先水平，而且该工艺操作简单，成本低，具有工业化应用的优势。

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Study on Separation and Purification Technology of γ-aminobutyric Acid by Whole-cell Bioconversion

Zhang Shu-cong，Liu Ting-ting，Yang Tao-wei，Xia Hai-feng，Rao Zhi-ming
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

A strain named Lactobacillus plantarum GB01-21 that can produce γ-aminobutyric(GABA)efficiently was screened in our laboratory.During the 20 hours，200g/L L-Glu can be transformed into 140g/L GABA.In this work，γ-aminobutyric was separated and purified from the whole-cell transforming solution.The decolorizing technical conditions such as temperature，time，pH and amount of active carbon were studied.As a result，the optimum decolorization conditions were determined through single factor and orthogonal experiments as follows:activated carbon dosage 1.5%，decolorization temperature 70 ℃，pH value 4.0 and decolorization time 30 min.Under these conditions，the decolorization rate and recovery rate of bioconversion broth reached 98.42%and 97.23%，respectively.Finally，γ-aminobutyric acid was isolated and purified from bioconversion broth and the recovery rate and the purity of γ-aminobutyric acid was 89.4%and 96.7%，respectively.These findings pave the way for industrial production of GABA.

γ-aminobutyric acid，whole-cell transforming，decolorization，separation and purification

硕士研究生(饶志明教授为通讯作者)

*国家“863计划”(2007AA02Z207);国家自然科学基金(30970056);霍英东青年基金(121020)

2010－06－03，改回日期:2010－06－28