转基因草菇高产多功能纤维素酶的培养条件*

郑兰娟，林俊扬，林俊芳，郭丽琼

1(华南农业大学食品学院生物工程系广东 广州，510640) 2(华南农业大学生物质能研究所，广东广州，510640)3(福建省莆田市农科所，福建莆田，351144)

转基因草菇高产多功能纤维素酶的培养条件*

郑兰娟1，2，林俊扬3，林俊芳1，2，郭丽琼1，2

1(华南农业大学食品学院生物工程系广东 广州，510640) 2(华南农业大学生物质能研究所，广东广州，510640)3(福建省莆田市农科所，福建莆田，351144)

以转多功能纤维素酶基因(mfc)草菇子代中单孢分离获得的高产多功能纤维素酶菌株TVM186为研究对象，分析固态发酵对该工程菌株产多功能纤维素酶(MFC)的影响。通过单因素试验分析麸皮粉、大豆粉、香蕉皮粉等对MFC活性的影响，确定发酵主要影响因子为麸皮粉和大豆粉，适宜配比为质量比1∶1;利用均匀设计分析发酵条件对该菌株产MFC的影响，结果表明:草菇工程菌株TVM186固态发酵的适宜培养条件为:培养基起始pH值7.4，接种量6%，温度34℃，时间10 d，含水量64%，装料量18.5 g，其酶活力可达到木聚糖酶(Xylanase)1 427.38 U/g、内切-β-1，4-葡聚糖酶(CMCase)597.59 U/g。

草菇，固态发酵，木聚糖酶，内切-β-1，4-葡聚糖酶，多功能纤维素酶

纤维素酶是能把纤维素分解成葡萄糖和其他化学物质的酶的总称［1－2］，现已广泛应用于食品、饲料、能源、造纸、纺织等行业［3－8］。目前纤维素酶的生产存在着产酶量低，酶成分单一，培养滤液分解天然纤维素能力差等问题;而且纤维素酶是诱导酶，在其生产中要求培养基含有各种原料来为产酶提供必需的C、N源或诱导物，但成分过多，不仅会增加原料成本，还会降解单位酶活，使得纤维素酶在纤维素资源的转化及食品工业、畜牧业上的应用受到限制［9－12］。固态发酵生产纤维素酶可以选用任何的天然纤维素废弃物，而且产量一般比液态发酵高出2～3倍，因此可以大幅度降低成本［13－14］，并且通过优化培养，可以降低纤维素酶生产成本［15］。

多功能纤维素酶(MFC)是从草食性软体动物福寿螺的胃液中分离纯化得到的一种纤维素酶，该酶同时具有外切β-1，4-葡聚糖酶，内切β-1，4-葡聚糖酶和内切β-1，4-木聚糖酶等3种活性，能同时降解纤维素和半纤维素［16］。本课题组从福寿螺的组织细胞中克隆多功能纤维素酶基因(mfc)［17］，采用多种启动子在灰盖鬼伞、银耳芽孢、草菇中进行了表达研究［18］。本研究是在以草菇gpd启动子连接mfc转化草菇经过筛选获得转基因草菇工程菌株(另文报道)，通过转基因草菇的培养种植，在转mfc草菇子代中单孢分离并筛选得到的高产多功能纤维素菌株TVM186的基础上，以廉价的农产品及其副产物作为发酵培养基，通过筛选最佳的固体发酵培养基及室内发酵条件，以期获得草菇mfc工程菌株高产MFC的发酵培养条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

草菇工程菌株TVM186，从转多功能纤维素酶基因(mfc)草菇的子代中分离并筛选获得，为高产菌株。

1.1.2 培养基

斜面培养基:马铃薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、琼脂 20 g、水 1 000mL。

固体发酵培养基:稻草粉、麸皮粉、玉米粉、黄豆粉、香蕉皮粉、甘蔗渣粉或菠萝皮粉10 g，分别加20mL自来水混匀，pH自然。

1.1.3 主要试剂

燕麦木聚糖(X0627)为Sigma公司产品，羧甲基纤维素钠，3，5-二硝基水杨酸，酒石酸钾钠，NaOH，无水Na2SO3、水饱和酚及原料均为国产。

1.2 试验方法

1.2.1 酶活测定方法

参照文献［19］测定。

1.2.2 培养方法

将活化好的菌种以4%～6%的接种量接种于已灭菌的固体发酵培养基中，32℃培养数天后，自来水浸提，5 000 r/min离心20 min，取上清液作为供试样品，测定酶活。

2 结果与分析

2.1 不同培养料对产酶的影响

采用麸皮粉、玉米粉、甘蔗渣粉、稻草粉、菠萝皮粉、黄豆粉和棉籽壳粉等作为单一培养料进行固态发酵产酶试验，以木聚糖酶(Xylanase)和内切-β-1，4-葡聚糖酶(CMCase)酶活力作为评价MFC酶活力的指标。结果表明(图1)，麸皮粉作为单一培养料时菌株的产酶量显著高于其他培养料，其Xylanase、CMCase分别达到1 008.72 U/g，362.14 U/g。其次是黄豆粉，Xylanase、CMCase 分别达到 586.41 U/g，277.79 U/g，而其他几种培养料其酶活力水平与麸皮相比都较低，菠萝皮粉及甘蔗渣粉为培养料时没有检测到酶活，可能是菠萝皮属于酸性物质，而草菇适合在偏碱性的环境中生长;甘蔗渣中残留的蔗糖等物质，可能对草菇的生长和产酶具有抑制作用，故草菇在以菠萝皮粉及甘蔗渣粉为培养料时产MFC酶活很低，很难检测到酶活。

图1 不同培养料对产酶的影响

2.2 复合培养料对产酶的影响

为了进一步提高酶活，对单一的麸皮培养料中添加其他成分，进行复合培养料的固体发酵。图2是麸皮添加等量的其他培养料进行复合培养的试验结果，由图2可知黄豆粉和麸皮粉复合培养产酶最显著，其Xylanase、CMCase 分别达到 1 299.58 U/g，421.85 U/g，比单一麸皮成分Xylanase提高了22.89%，CMCase提高了14.17%。

图2 复合培养料对菌株产酶的影响

为了优化复合培养基中黄豆粉和麸皮粉的比例，图3显示了添加不同比例的黄豆粉和麸皮粉的复合培养试验的结果。以适当比例添加黄豆粉有利于菌株的产酶:当黄豆粉:麸皮粉组分比(质量比)为2∶8时，其产酶量与单一的麸皮培养料相当，当组分比调整至5∶5时，酶活力产生较大增幅，增幅为菌株以麸皮作为单一培养料时产酶量的12%～30%;继续增加黄豆粉的量不能使产酶量增加。原因可能是:在麸皮培养基中适量添加黄豆粉，改善了固体培养基质的通气及散热条件，较利于菌株的生长和MFC的合成，但当黄豆粉的量增加而麸皮的量减少时，麸皮中所含有的宜于菌株利用的生长因子的量随之减少，从而导致菌株产酶量大幅降低。故选择m(麸皮粉):m(黄豆粉)=1∶1做为最适复合培养料配比。

图3 复合培养料配比对菌株产酶的影响

2.3 固态发酵条件对产酶的影响

以复合培养料［m(麸皮粉)∶m(黄豆粉)=1∶1］作为固体发酵培养基，采用均匀设计表U10×(108)安排试验，考察不同的培养温度(℃)、pH值、含水量(%)、装料量(g)、接种量(%)及培养时间(d)对菌株产酶(Xylanase，CMCase)的影响，每个处理重复2次，试验结果如表1所示。

利用SAS8.1软件进行数据处理。通过逐步回归考察对Y起显著影响的因子，剔除对Y的影响不显著的因子，得到 Y1与因子 X1、X2、X3、X4、X5、X6之间的回归方程为Y1=906.2× X1+570.9×X2－95.5×X3－51.4×X4－171.3×X5－32.8×X1X1+153.6×X1X2－390.7×X2X2+2.8×X1X3－11094。Y2与因子 X1、X2、X3、X4、X5、X6之间的回归方程为Y2=444.2×X1+256.0×X2－39.95×X3－22.7×X4－73.2×X5－15.3×X1X1+70.8×X1X2－180.1× X2X2+1.2× X1X3－5 726.4。

表1 均匀实验设计及实验结果

从表1可以看出第5次试验的发酵条件是10次试验中最好的，即34℃、pH值9.5、含水量67%、装料量11 g、接种量4%、培养10 d。这个最佳发酵条件和最优发酵条件常常是很接近的。上面得到的回归方程一般仅在试验范围内成立，通过回归旋转分析得出xylanase理论最优发酵条件为:34℃、pH值7.4、含水量62%、装料量18.5 g、接种量6%、培养9.5 d，Y1值为1 453.68 U/g。CMCase理论最优发酵条件为34℃、pH7.4、含水量 64%、装料量 18.5 g、接种量6%、培养9.5 d，Y2值为672.26 U/g。因为Xylanase、CMCase是多功能纤维素酶表现出来的不同酶活性，其发酵条件应是相同的，故确定多功能纤维素酶固体发酵条件为:34℃、pH值7.4、含水量为64%、装料量18.5 g、接种量6%、培养10 d。

2.4 验证结果分析

经SAS软件逐步回归，得出最高指标时各个因素组合为 X1=34℃、X2=7.4、X3=64%、X4=18.5 g、X5=6%、X6=10 d，此时 Xylanase、CMCase 最高酶活应为1 453.68 U/g、672.26 U/g。经验证，在如上条件下3次实验的平均结果为:xylanase、CMCase酶活分别为1 427.38 U/g、597.59 U/g，与回归的理论值基本偏差不大。说明该方法对草菇工程菌株TVM186发酵培养基优化是可行的。

3 讨论与结论

纤维素酶是诱导酶，培养基中纤维素的含量直接影响纤维素酶的产生。课题组对其培养基进行大量的摸索，结果发现麸皮作为单一培养料时菌株产酶量显著高于其他单一培养料，原因是麸皮中含淀粉、纤维素、半纤维素、有机氮及生长因子等丰富营养物质［20］可促进菌丝的生长，所含的纤维素和半纤维素可能对酶的合成具有诱导作用，故其在麸皮培养基上生长情况较好，很多研究者的研究结果也表明了这一点［21－22］。黄豆粉不适合菌丝生长，但与麸皮粉的混合有利于产酶。因此，麸皮粉和黄豆粉的混合物是草菇TVM186菌株发酵的理想培养基。

纤维素酶的生产有固体发酵和液体深层发酵两种方法，前者无论是产量上还是质量上均优于后者，固体发酵比液体发酵具有更高的产率，D.S.Chahal通过对文献已报道的2种发酵工艺产率的分析比较，发现固态发酵酶产率(250～430 IU/g纤维素)比液态发酵酶产率(160～250 IU/g纤维素)增加约72%［23］。在我们的研究过程中，也同时对 TVM186菌株的液体发酵条件进行了研究，结果表明:固态发酵培养，TVM186菌株的 Xylanase酶产率提高了75%，CMCase酶产率提高了86%。由于目前国内外应用的产纤维素酶的菌种大多系真菌，真菌习性在静止条件下生产，并要求菌丝体紧密接触纤维素类物质，故而在液体搅拌中生长不良。纤维素基质是不溶性的，亦不利于液态发酵。在液态搅拌发酵中，真菌在发酵罐内只长菌丝体，真菌不同部位分泌的酶的酶组分存在差异，故而液体发酵酶组分没有生长完全的固体发酵酶组分丰富和比例适当。故本试验最终确定采用固体发酵作为MFC的发酵途径。

通过均匀设计分析，草菇TVM186菌株在34℃，pH值7.4，含水量64%，装料量18.5 g，接种量6%，培养10 d的条件下，Xylanase和 CMCase的酶活分别可达到1 427.38 U/g、597.59 U/g，比优化前分别提高了9%和29%。

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Culture Conditions of Transgenic Volvariella volvacea for High Production of Muli-Functional Cellulase

Zheng Lan-juan1，2，Lin Jun-yang3，Lin Jun-fang1，2，Guo Li-qiong1，2
1(Doparenent of Bioengineering College of Food Science，South China Agricultanol Vuiversity，Guangzhou 510640，China)2(Lnstitute of Bionass Research，South China Agricultural Vniversity，Guangzhou 510640，China)3(The lnstitute of Agriculture Science，Putian 351144，China)

TVM186 with high MFC activity was separated by monospore isolation from the transformants of Volvariella volvacea.Solid substrate fermentation was performed to investigate the optimum fermentation conditions for enzyme production of the transgenic V.volvacea.Several single factors on fermentation of strain TVM186 were studied in this research.The result showed that the optimum culture conditions of solid state fermentation were wheat bran power and soybean power with allocated proportion is 1∶1.The optimum solid state fermentation conditions of TVM186 were initial pH 7.4，inoculation 6%，temperature 34℃，fermentation time 10 d，water ratio 64%，substrate 18.5 g using uniform design experiment.The highest Xylanase and CMCase activity were 1 427.38 U/g and 97.59 U/g respectively.

Volvariella volvacea，solid substrate fermentation，Xylanase，CMCase，Muli-Functional Cellulase

硕士研究生(郭丽琼教授为通讯作者)。

*国家863项目(2006AA10Z301);“十一五”国家科技支撑计划重点项目子课题(2008ADA1B02);国家自然科学基金项目(30871768)资助

2010－04－14，改回日期:2010－07－27