乳酸菌发酵剂菌体自溶及产酶特性

孙 洁，吕加平，刘 鹭，张书文

（1.中国农业科学院农产品加工研究所，北京100193；2.农业部规划设计研究院，北京100125）

乳酸菌发酵剂菌体自溶及产酶特性

孙 洁1，2，吕加平1，*，刘 鹭1，张书文1

（1.中国农业科学院农产品加工研究所，北京100193；2.农业部规划设计研究院，北京100125）

使用自溶度不同的乳酸菌发酵剂来控制产品的成熟周期及感官风味，具有良好的指导意义和实用价值，本文通过对嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和乳酸乳杆菌自溶度的研究表明，菌体自溶特性除了与菌株密切相关外，培养条件也会对其产生一定影响；在一定范围内，菌体自溶度随培养温度和pH的升高而增大，但超出这一范围，过高的培养温度和pH又会抑制菌体的自溶；乳酸菌自溶速度越快，产生并释放的蛋白酶和脂肪酶酶活性达到峰值所需时间就越短；相同培养条件下，乳酸乳杆菌产脂肪酶酶活性最高，三个菌株（SY15、SY15－3、SY26）产酶活性达到24.11～46.23U；德氏乳杆菌保加利亚亚种产蛋白酶活性最高，四个菌株（LD1、LD1－3、LD3、LD3－3）产酶活性最低为27.63U（LD3－3）、最高为45.22U（LD1－3）。在乳酸菌发酵剂的使用过程中，应根据实际需要对自溶度不同的菌株进行选择。

乳酸菌，自溶，脂肪酶，蛋白酶

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试菌株 均来自于本实验室保藏菌株，经APIOR试剂盒（生物－梅里埃公司，法国）鉴定，置信区间均在98%以上，分别为嗜热链球菌（Streptococcus salivarius ssp.），标记为GS1、GS2、GS3；德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii ssp.Bulgaricus），标记为 LD1、LD1－3、LD3、LD3－3；乳酸乳杆菌（Lactococcus lactis ssp.Lactis），标记为SY15、SY15－3、SY26。菌株纯化后用冷冻干燥机（LGJ－10中国北京四环）真空冻干成粉，保存于－80℃低温冰箱，使用时经由MRS肉汤培养基（中国北京陆桥）于37℃条件下培养活化3代，储存于4℃冰箱备用。

1.2 菌株培养

活化菌株于MRS肉汤培养基37℃培养至稳定期，离心收集菌体细胞（4000r/min，10min），以无菌水洗涤两次，离心收集菌体细胞备用。

1.3 不同温度条件对菌株自溶的影响

将1.2中所得菌体细胞重悬于 PBS缓冲液（50mmol/L pH6.5）中，调整菌液吸光值（OD650nm）至1.0左右，分别置于4、10、25、37、45℃温度条件下进行培养，于0、2、4、8、12、24h时取样测定。

1.4 不同pH条件对菌株自溶的影响

将1.2中所得菌体细胞重悬于pH分别为4.5、5.5、6.5、7、7.5的PBS缓冲液（50mmol//L）中，置于37℃温度条件下培养，其他条件同1.3，于0、2、4、8、12、24h时取样测定。

1.5 菌体自溶度的检测

将1.3和1.4中所得菌液置于石英杯中，使用分光光度仪（U－3010 Hitachi日本）测定其波长为650nm处的吸光度，自溶度计算公式如下［6］。

其中：A1为菌液吸光值；A2为菌液初始吸光值［7］。

1.6 蛋白酶活性的测定

其中：ΔA为样品与空白对照的吸光值之差；K为吸光常数；n为反应总体积；t为反应时间。根据本次实验中酪氨酸标准曲线（图1所示）确定K=76.89。

1.7 脂肪酶活的测定

脂肪酶活的测定采用碱滴定法［9］，略有改进：将4%聚乙烯醇与化学纯级橄榄油按3∶1的比例混合，冷却至4℃后用组织捣碎机乳化10min，使其成为乳白、分散均匀的底物乳化液，冰箱保存备用。测定时将5mL磷酸缓冲液（0.025mol/L，pH 7.5）和4mL上述乳化底物置于100mL三角瓶中混合，于40℃水浴5min；然后加入1mL待测菌液摇匀继续水浴，精确计时15min，立即向三角瓶内加入95%乙醇15mL以终止反应；向三角瓶内滴加1%酚酞指示剂1～2滴，使用微量滴定管，用0.01mol/L的NaOH溶液滴定至微红色，记录耗碱量；以未加菌液的体系滴定值设置空白对照。酶活力定义为：在40℃、pH 7.5的条件下，脂肪酶每分钟分解脂肪产生1μmol游离脂肪酸所需要的酶量（单位）定义为一个脂肪酶酶活性单位U。计算公式为：

图1 酪氨酸标准曲线

式中：A为NaOH消耗量；B为空白对照组NaOH消耗量；t为反应时间。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的自溶特性

2.1.1 不同菌株间自溶度差异 在37℃条件下将各菌株悬浮于PBS缓冲液（50mmol/L pH6.5）中孵育，不同时间取样测定菌株自溶度，结果如图2所示。

图2 不同菌株在相同环境中的自溶度差异

不同菌种的自溶度有很大差异，在pH 6.5、37℃条件下培养24h，德氏乳杆菌保加利亚亚种的自溶度最大，其四个菌株的自溶度分别在42%～61%之间；乳酸乳杆菌的自溶程度最小，三个菌株的自溶度均在11%以下，其中菌株SY15在24h之内几乎没有发生自溶。同种乳酸菌的不同菌株之间自溶度也有一定差异，例如嗜热链球菌三个菌株的自溶度分别为20.8%（GS2）、6.8%（GS1）和9.6%（GS3）。

2.1.2 培养温度对乳酸菌自溶的影响 培养温度对乳酸菌的自溶有较大影响，以杆菌LD1－3和球菌GS2为例，结果如图3所示。

在4℃和15℃的低温条件下，乳酸菌的生长基本处于停滞状态，此时菌体的自溶度也降至最低。在25～42℃范围内，乳酸菌的自溶程度明显随环境温度的升高而增大，菌株LD1－3和GS2在42℃条件下孵育24h，较25℃条件下的自溶度分别提高了43.6%和41.5%。较高的环境温度对杆菌LD1－3自溶的促进作用比对球菌GS2更明显。在高温环境中，乳酸菌的自溶呈现一种先扬后抑的趋势，在孵育初期，55℃条件下菌株自溶度比42℃条件下高，孵育后期前者的自溶度又开始低于后者。可见过高或过低的培养温度，都因其不利于菌体生长而影响了菌体自溶酶的转录表达，或抑制其活性，从而降低了菌体的自溶程度。

2.1.3 环境酸度对乳酸菌自溶的影响 乳酸菌培养的环境pH对菌体的自溶也有一定影响，图4所示为菌株LD1与GS2在不同pH条件下孵育的自溶情况。

(2)改革工艺，减少产尘量。选煤厂适当提高入选上限，减少煤的破碎量，或适当调整破碎机的工艺参数，尽量减少过粉碎，均可大大减少煤尘数量。

图3 不同培养温度对菌株自溶的影响

图4 不同环境pH对菌株自溶的影响

关于环境酸度对乳酸菌自溶的影响的研究结论不尽相同，Tetsuya等学者［5］认为乳酸菌在低pH条件时自溶程度较大；但是李艾黎等［10］的研究又认为较低的pH会抑制菌体的自溶。

本研究发现：较高的pH更有利于菌体的自溶，尤其是在菌体培养初期（0～8h），pH的升高可显著增大菌体自溶程度，例如菌株LD1在pH4.5的条件下培养24h，其自溶度为18.8%；当pH升至7时，自溶度则达到了46.3%；同样，菌株GS2在pH4.5与pH7条件孵育的自溶度分别为9.4%与25.5%，二者均有一倍左右的增长。但是当pH继续增大时，这种趋势又发生了改变：在pH7.5孵育时，菌株LD1和GS2的自溶程度都较pH7时有所降低，这一趋势在其他菌株实验中均有体现。由于乳酸菌的自溶是一种自发的生理过程，这一过程受很多因素影响，有着复杂的调控机制，不同菌株的自溶行为对环境酸度的敏感度不同，同时还可能与培养时所用缓冲液的种类、浓度及其他环境因素有一定关系，因此才出现pH对自溶影响结果的矛盾报道。

通过上述实验发现：在37℃、pH 6.5环境条件下，大多数乳酸菌的自溶程度都处于一个中间、稳定的状态，因此也将其确定为下一步实验的孵育条件。

2.2 乳酸菌产生脂肪酶的活性与自溶度的关系

不同乳酸菌产生脂肪酶的活性如图5所示。

图5 不同乳酸菌产生的脂肪酶酶活性

在培养过程中，不同乳酸菌产生脂肪酶活性的峰值以及到达峰值的时间都有很大差别，由图5可见，乳酸乳杆菌的脂肪酶活性最高，三个菌株产酶的酶活在24.11～46.23U范围内；德氏乳杆菌保加利亚亚种产脂肪酶的活性最低，在15.12～18.17U范围内；嗜热链球菌的脂肪酶活性基本上在26U左右，虽然实验菌株自溶程度并不相同，但其产生脂肪酶的酶活峰值却十分相近。图6中所示即为嗜热链球菌三菌株在自溶期间脂肪酶活性的变化。图中可见，在37℃、pH 6.5条件下，三个菌株的脂肪酶活性随着培养时间的推移而逐步增大，达到峰值后又有一定程度的下降。乳酸菌产脂肪酶酶活性到达峰值的时间与菌株的自溶度有一定相关性，菌株GS1、GS2和GS3在孵育24h后的自溶度分别为6.8%、20.8%和9.6%，由图中可知，自溶度较大的菌株GS2，其脂肪酶活性达到峰值所需时间比自溶度小的菌株GS1、GS3所需时间短。

图6 不同嗜热链球菌菌株自溶期间脂肪酶活性的变化

2.3 不同乳酸菌产生蛋白酶活性与自溶度的关系

不同乳酸菌产生蛋白酶的活性如图7所示。

图7 不同乳酸菌产生的蛋白酶酶活性

由图7可知，德氏乳杆菌保加利亚亚种产蛋白酶的酶活性远高于其余两种乳酸菌，其中3个菌株的酶活性均在40～46U之间；嗜热链球菌产蛋白酶的活性在12.66～15.23U之间；乳酸乳杆菌的脂肪酶活性最高，但其蛋白酶的活性却最低，均在7.63～10.11U之间。图8中所示为GS1、GS2和GS3在自溶期间蛋白酶活性的变化情况。由图中可见，在37℃、pH6.5条件下，三个菌株的蛋白酶活性随孵育时间的推移而逐步增大，达到峰值之后又开始下降。自溶度高的菌株GS2产蛋白酶酶活到达峰值的时间约为36h左右，而自溶度较低的菌株GS1约为45h左右。

图8 不同菌株嗜热链球菌自溶期间蛋白酶活性变化

3 结论

不同菌种或菌株其自溶程度不同，同时菌株的生长环境对自溶也有一定影响：过高或者过低的培养温度和pH都可抑制乳酸菌的自溶，每种乳酸菌都存在一个最适宜的培养条件，在该条件下菌体繁殖最稳定。通常在高于45℃的培养条件下，菌体在对数生长期因自溶过快会导致活菌数急剧下降，不利于乳酸菌的增殖；在4～10℃低温条件下，菌体几乎不发生自溶。培养环境pH的升高也会增大菌体的自溶程度，过酸的环境则会抑制菌体自溶。

相同培养条件下，乳酸乳杆菌产脂肪酶活性最高，嗜热链球菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种次之，而产蛋白酶活性最高的是德氏乳杆菌保加利亚亚种，嗜热链球菌与乳酸乳杆菌次之。乳酸菌产生的脂肪酶和蛋白酶活性变化与菌株自溶程度有密切的关系，自溶度越大的菌株产酶活性到达峰值的时间越短。所以在乳酸菌发酵剂的选择过程中，应根据所需目的的不同，针对各种目标菌群进行分析，找到最适合的培养条件，或者通过添加自溶度不同的菌株来加速或降低发酵剂的自溶程度，从而达到生产所需的目的，使之成为适合工业生产的优良发酵剂。

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Lipase and protease activities and autolysis properties of lactic acid bacteria

SUN Jie1，2，LV Jia－ping1，*，LIU Lu1，ZHANG Shu－wen1
（1.Institute of Agro－food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Lab of Agricultural Product Processing and Quality Control，Ministry of Agriculture，Beijing 100193，China；2.Chinese Academy of Agricultural Engineering，Beijing 100125，China）

The autolysis properties of lactic acid bacteria are crucial for their applications as dairy starters.The autolysis rate of S.salivarius ssp.，L.delbrueckii ssp.Bulgaricus and L.lactis ssp.Lactis were determined under various conditions of incubated temperature and pH values，as these factors were closely related to cell viability and flavor development in the products.Autolysis increased when temperature and pH values were rising in a certain range.Over the range，higher or lower temperature and pH value would inhibit the autolysis rate of strains. Lipase and protease activities were closely related to the sort of strains.Time of reaching the highest activities for lipase and protease depended on the autolytic degree of strains.All L.lactis ssp.Lactis strains showed higher lipase activities，and protease activities in L.delbrueckii ssp.Bulgaricus were mostly higher than other strains.These properties should be considered when commercial starters were selected.

lactic acid bacteria；autolysis；lipase；protease

TS201.3

A

1002－0306（2010）12－0164－04

乳酸菌以其优良的发酵特性及益生功能在化工及食品工业中的地位毋庸置疑，近年来大量文献报道了通过优化发酵工艺来有效增加乳酸菌活菌数，此外通过基因调控等方式改善乳酸菌在生产过程及产品中的生长状态也成为当前研究热点之一。乳酸菌自溶（Autolysis）是指在一定的条件下，菌体细胞自身释放某些酶类水解细胞壁肽聚糖的网络结构而导致其裂解，胞内物质向周围环境释放的过程［1］，这些酶类被称之为自溶酶（autolysin）。关于细菌自溶的确切机制尚不清楚，但可以肯定的是，自溶是细胞在生长过程中不可或缺的正常现象［2］。乳酸菌的自溶特性对发酵乳制品品质影响较大，以干酪为例，发酵剂乳酸菌的快速自溶不仅可缩短成熟周期、降低生产成本，而且菌体自溶后释放的多种蛋白酶类和脂肪酶，又决定着干酪风味及感官特性［3－5］。同样在酸奶制作中，发酵剂菌株的自溶不但影响酸奶风味和感官品质，也会造成活菌数下降、酸奶保健功能降低等负面影响。但适度的自溶又可减少酸奶后酸化及改善风味。所以，研究乳酸菌自溶特性及菌株在自溶期间释放的主要酶活性变化规律，对改进干酪和酸奶品质具有重要的指导意义。本文以发酵乳制品生产中最常用的三种乳酸菌为研究对象，通过比较不同菌株的自溶规律及其菌体释放的蛋白酶与脂肪酶酶活性变化，初步探讨自溶程度的影响因素及菌体脂肪酶与蛋白酶活性变化与自溶度的相关关系。

2009－11－23 *通讯联系人

孙洁（1980－），女，博士，研究方向：食品微生物与乳品加工。

国家科技部“十一五”奶业产业化支撑计划（2006BAD04A07，2006BAD04A10）。