尿素包合法纯化孔石莼不饱和脂肪酸

楼乔明，丛培旭，徐 杰，薛长湖

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

尿素包合法纯化孔石莼不饱和脂肪酸

楼乔明，丛培旭，徐 杰，薛长湖*

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

用Folch法提取孔石莼总脂，经皂化后酸化制得脂肪酸，再对脂肪酸进行尿素包合，使其中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸分离，从而提高不饱和脂肪酸的含量。在脂肪酸∶尿素∶无水乙醇比为1∶2∶20，温度为4℃，包合12h的条件下进行尿素包合结晶，效果较好，不饱和脂肪酸含量由72.43%增加到96.91%，其中十六碳四烯酸由13.63%增加到22.92%，增加68.16%，十八碳四烯酸由20.99%增加到38.82%，增加84.95%。

孔石莼，尿素包合，纯化，不饱和脂肪酸

孔石莼（Ulva pertusa Kjellm）属于绿藻门石莼科石莼属，是一种大型绿藻，俗称海菠菜、海白菜等，广泛分布于西太平洋沿海，是我国野生经济藻类中资源极为丰富的一种［1］。自古以来孔石莼在食用和药用方面就有广泛的应用。明朝李时珍的《本草纲目》中有“下水、利小便”之功效记载。孔石莼脂肪酸中含有大量的十六碳四烯酸（C16∶4）、十八碳三烯酸（C18∶3）、十八碳四烯酸（C18∶4）等多不饱和脂肪酸［2］，而这些多不饱和脂肪酸都可以作为二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）的合成前体［3－4］。但是，当前对孔石莼的利用还相当有限，除了少量食用和药用外，仅有一些作为饲料和肥料，对其药用等价值也尚未得到充分开发［5］。本文通过尿素包合法对孔石莼的不饱和脂肪酸，尤其是十六碳四烯酸和十八碳四烯酸进行纯化，为孔石莼资源的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇、三氯甲烷、正己烷、石油醚、尿素（分析纯）等 由天津市科密欧化学试剂有限公司提供。

6980N型气相色谱仪 美国 Agilent公司；Laborota 4000 efficient旋转蒸发器 德国海道尔夫公司；AB135－S型精密电子分析天平 瑞士梅特勒－托利多公司；Milli－Q Synthesis超纯水系统 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

孔石莼于2009年11月采自青岛栈桥附近海域，自来水清洗，除去泥沙和其他杂草；样品冷风吹干，室温保存。

1.2.1 总脂提取 取一定量的孔石莼，粉碎，按1∶20（m∶v）的量加入氯仿－甲醇（2∶1，v∶v）混合液，超声30min，然后浸提24h。过滤后，浸提液用0.9%氯化钠溶液洗涤，倒入分液漏斗中静置分层。下层（氯仿层，墨绿色）用无水硫酸钠干燥后，蒸发浓缩，得到墨绿色浸膏。

1.2.2 混合脂肪酸的制备 所提浸膏用 1mol/L KOH－乙醇溶液100mL，于70℃水浴加热回流，皂化2h。皂化液冷却至室温后，加入适量水使皂化液完全溶解，用30mL石油醚萃取3次，弃去醚层，除去不皂化物。水层用10%盐酸酸化至pH1～2，静置分层，石油醚萃取有机相3次，合并石油醚并用水洗至中性，无水硫酸钠干燥，减压旋转蒸干，得混合脂肪酸。

1.2.3 尿素包合 将上述所得的混合脂肪酸，按脂尿比（1∶2）［6］、尿素乙醇比（1∶10）进行实验。将尿素于70℃水浴中回流溶解，加入制备的混合脂肪酸，搅拌冷却至室温，于4℃包合结晶12h。结晶后，加入活性炭搅拌脱色10min，并进行抽滤，所得滤液加入等体积水和两倍体积的氯仿进行萃取，氯仿层用无水硫酸钠干燥，蒸干滤液，得脂肪酸。

1.2.4 脂肪酸甲酯化 取一定量样品，加入1mL 2mol/L HCl－甲醇溶液，于60℃水浴中甲酯化15min，冷却后加入正己烷和饱和氯化钠溶液各1mL振荡，静置分层，取上清液供气相分析。

1.2.5 气相色谱分析 HP－INNOWax石英毛细管柱（30m×0.32mm），高纯氮气为载气，采用恒压模式，压力为 7.81psi，分流比为 25∶1。进样口温度为230℃，检测器温度为250℃，柱温以3℃/s由170℃升到210℃，然后在210℃下保持10min，最后对各组分峰用面积归一法进行积分，得出各组分的百分含量。

2 结果与讨论

2.1 尿素包合条件

尿素包合法是纯化不饱和脂肪酸的一种有效方法。尿素分子在结晶过程中能够与饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸形成稳定的晶体包合物析出，而多不饱和脂肪酸由于双键较多，碳链弯曲，具有一定的空间构型，不易被尿素包合［7］。在尿素包合过程中，对不饱和脂肪酸富集效果影响最大的因素是尿素用量，如果尿素量过少，对饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸的包合程度就会下降，达不到理想效果；同时尿素量过多时，尿素物理携带的不饱和脂肪酸越多，导致富集得率降低。而溶剂乙醇的用量、尿素包合温度和时间对不饱和脂肪酸富集效果影响不大［6，8］；但增加乙醇用量有利于后续活性炭脱色。因此本实验在脂尿比（1∶2）、尿素乙醇比（1∶10），4℃包合12h下进行操作。

通过皂化后酸化所得的混合脂肪酸含有大量的色素。在尿素包合结晶后，加入活性炭进行脱色。过滤除去结晶的尿素和活性炭。加入等体积水和两倍体积的氯仿，以萃取不饱和脂肪酸和除去乙醇中未结晶的尿素。氯仿层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，最后得到淡黄色脂肪酸液体。

2.2 尿素包合前后脂肪酸分析

图1 尿素包合前孔石莼脂肪酸气相色谱图

尿素包合前后脂肪酸的气相色谱图见图1、图2，脂肪酸分析结果见表1。结果表明：尿素包合前，孔石莼中饱和脂肪酸含量为27.57%，主要为棕榈酸（24.84%）和月桂酸（2.73%）；不饱和脂肪酸含量为72.43%，主要为十八碳四烯酸（20.99%）、十六碳四烯酸（13.63%）、十八碳三烯酸（13.56%）等多不饱和脂肪酸。尿素包合后，不饱和脂肪酸含量增加到96.91%，多不饱和脂肪酸含量由 52.15%增加到85.44%，增加63.84%，其中十六碳四烯酸由13.63%增加到 22.92%，增加 68.16%；十八碳四烯酸由20.99%增加到38.82%，增加84.95%。综合分析结果，按脂尿比（1∶2）、尿素乙醇比（1∶10），4℃包合12h条件进行尿素包合结晶，对饱和脂肪酸具有较好的包合作用，达到孔石莼不饱和脂肪酸的富集纯化效果。

图2 尿素包合后孔石莼脂肪酸气相色谱图

表1 尿素包合前后孔石莼脂肪酸相对含量

3 结论

3.1 尿素包合法是富集纯化孔石莼不饱和脂肪酸的一种有效方法，具有简便、经济、高效等特点，所用试剂简单易得，且均可回收，适合于工业化生产。

3.2 通过尿素包合后，不饱和脂肪酸的含量由72.43%增加到96.91%，达到了对孔石莼不饱和脂肪酸富集纯化的目的。

［1］王艳梅，李志恩，徐祖洪.孔石莼化学组分和药用活性研究进展［J］.海洋科学，2000，24（3）：1－2.

［2］吴志军，熊慧萍，李智恩，等.孔石莼脂溶性化学成分的分析［J］.海洋科学，2000，24（5）：3－4.

［3］张乐，蒲新明，梁彦娟，等.必需脂肪酸在海洋食物链中的作用［J］.海洋科学，2009，33（4）：66－71.

［4］Hazzard S E，Kleppel G S.Egg production of the copepod acartia tonsa in Florida Bay：role of fatty acids in the nutritional composition of the food environment［J］.Mar Ecol Prog Ser，2003，252：199－206.

［5］康凯，王长云，王斌贵，等.大型海藻孔石莼化学组分和生物活性研究新进展［J］.海洋湖沼通报，2007（3）：155－159.

［6］阮奇城，祁建民，黄李冉，等.红麻籽油脂肪酸成分分析及其亚油酸富集工艺的研究［J］.中国粮油学报，2009，24（9）：71－75.

［7］蒋艳忠.尿素包合法分离蚕蛹油中多不饱和脂肪酸［J］.化学研究与应用，2008，20（3）：363－366.

［8］靳革，申书昌.尿素包合法纯化山核桃油中的不饱和脂肪酸［J］.化工时刊，2009，23（6）：35－37.

Purification of unsaturated fatty acids from Ulva pertusa Kjellm by urea adduction

LOU Qiao－ming，CONG Pei－xu，XU Jie，XUE Chang－hu*
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

The total lipid of Ulva pertusa Kjellm was extracted using Folch method，saponificated and acidificated to obtain the fatty acids.The saturated fatty acids and unsaturated fatty acids were separated by the method of urea adduction，thus improved the content of unsaturated fatty acids.The results of the experiment were preferable at the ration of fatty acids，urea and ethano（l1∶2∶20），temperature（4℃），adduction time（12h）.The content of unsaturated fatty acids was raised from 72.43%to 96.91%，and content of hexadecatetraenoic acid raised from 13.63%to 22.92%，stearidonic acid from 20.99%to 38.82%，and increased 68.16%and 84.95%，respectively.

Ulva pertusa Kjellm；urea adduction；purification；unsaturated fatty acids

TS254.1

A

1002－0306（2010）12－0160－02

2009－12－28 *通讯联系人

楼乔明（1981－），男，博士研究生，研究方向：海洋活性物质研究。

国家科技支撑计划（2008BAD94B04）。