硝酸咪康唑乳膏微生物限度检查验证

丘展锋 黄国玉

建立硝酸咪康唑乳膏微生物限度检查方法，并对该法的有效性进行评价，通过试验确定了硝酸咪康唑乳膏的微生物限度检查方法。

1 材料与方法

1.1 培养基及试剂 营养肉汤培养基;改良马丁液体培养基;改良马丁琼脂培养基;玫瑰红钠琼脂培养基;营养琼脂培养基;司盘80;单硬脂酸甘油酯;聚山梨酯80;0.9%无菌氯化钠溶液;pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液;胆盐乳糖培养基;甘露醇高盐琼脂平板;十六烷三甲基溴化铵平板。

1.2 实验仪器 高压蒸汽灭菌锅、天平、净化间、净化工作台、恒温生化培养箱过滤器。

1.3 阳性对照菌:大肠埃希菌［CMcc(B)44102］;金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］;枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］;铜绿假单孢菌［ECMCC(B)10104］;白色念珠菌［CMCC(F)98001］;黑曲霉菌［CMCC(F)98003］(菌种均由中国药品生物制品检定所提供)。

1.4 硝酸咪康唑乳膏，广东庆发药业有限公司生产。

2 方法

2.1 供试品的制备 取供试品5 g，加至含溶化的(温度不超过45℃)5 g司盘80、3 g单硬脂酸甘油酯、10 g聚山梨酯80无菌混合物的三角烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液100 ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1∶20的供试液。

2.2 阳性对照菌液的制备 文献［1］取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢菌的营养琼脂斜面培养物接种于营养肉汤培养基中，35℃ 下培养18 h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1 ml中含菌数约为50～100 cfu的阳性对照菌液备用;另取白色念珠菌的改良马丁琼脂斜面培养物接种于改良马丁液体培养基中，25℃ 下培养24 h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1 ml中含菌数约为50～100 cfu的阳性对照菌备用;取黑曲霉斜面培养物，至改良马丁琼脂斜面培养基中培养5～7 d，加3～5 ml 0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，至无菌试管内，用0.9%氯化钠溶液稀释至每1 ml含菌数约为50～100cfu的阳性对照菌备用。

2.3 检查方法验证 依《中国药典》［1］2005年版二部附录ⅩⅢC“微生物限度检查方法”中薄膜过滤法过滤，用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 ml，最后一次冲洗，加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌取过滤膜贴于营养琼脂培养基，30℃ ～35℃培养48 h;加入白色念珠菌、黑曲霉取过滤膜贴于玫瑰红钠琼脂培养基2O℃～25℃培养72 h。①阳性对照菌液组:取“2.2”项下的对照菌液大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌各1 ml，分别注入平皿，倾注相应培养基培养后，计数。结果(见表1)。②稀释剂对照组:取含溶化的(温度不超过45℃)5 g司盘80、3 g单硬脂酸甘油酯、10 g聚山梨酯80无菌混合物的三角烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液100 ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20的供试液，取该供试液各1 ml分别加入含有100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中摇匀过滤，然后用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 ml，在最后一次冲洗液中分别加入“2.2”项下对照菌液大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌各1 ml滤干，取过滤膜贴于相应培养基平皿培养后，计数。结果(见表1);③供试品对照组:取“2.1.”制备的供试液各1 ml，分别加入含有100 ml0.9%氯化钠溶液中摇匀过滤，然后用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 ml滤干，取过滤膜贴于相应的培养基平皿培养后，计数。结果(见表1);④ 供试品试验组:取“2.1”制备的供试液各1 ml，分别加入含有100 ml0.9%无菌氯化钠溶液中摇匀过滤，然后用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 ml，在最后一次冲洗液中分别加入“2.2”项下对照菌液大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌各1 ml滤干，取过滤膜贴于相应培养基平皿培养后，计数。结果(见表1)。以上各组每次试验用2个平皿，试验重复3次。

表1 各菌种试验结果

2.3 控制菌检查方法的验证 ①金黄色葡萄球菌检查方法的验证:控制菌测定所用培养基，培养温度，培养时间:加金黄色葡萄球菌至100 ml营养肉汤培养基中培养，置35℃培养24 h后，划线于甘露醇高盐琼脂平板，置35℃培养24 h。

阳性对照组:取“2.2”项下对照菌液金黄色葡萄球菌1 ml，加入含有100 ml营养肉汤的培养基中培养，划线培养，观察。结果(见表2)。阳性试验组:取“2.1”制备的供试液20 ml，加入含有500 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中摇匀过滤，然后用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗5次，每次100 ml，在最后一次冲洗液中加入“2.2”项下对照菌液金黄色葡萄球菌滤干，取膜接种于含有100 ml营养肉汤的培养基中培养，划线培养，观察。结果(见表2)。

供试品对照组取“2.1.”制备的供试液20 ml，加入含有500 ml 0.9%无菌氯化钠溶中混合过滤，然后用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗5次，每次100 ml滤干后，取膜接种于含有100 ml营养肉汤的培养基中培养，观察。结果(见表2);②铜绿假单孢菌检查方法的验证;控制菌测定所用培养基，培养温度，培养时间:加铜绿假单胞菌至100 ml胆盐乳糖培养基中培养，置35℃培养24 h后，划线于十六烷三甲基溴化铵平板，置35℃培养24 h。

阳性对照组:取“2.2”项下对照菌液铜绿假单胞菌1 ml，加入含有100 ml胆盐乳糖的培养基中培养，划线培养，结果(见表2)。阳性试验组:取“2.1.”制备的供试液20 ml，加入含有500 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中摇匀过滤，然后用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗5次，每次100 ml，在最后一次冲洗液中加入“2.2”项下对照菌液铜绿假单胞菌滤干，取膜接种于含有100 ml胆盐乳糖的培养基中培养，划线培养，观察。结果(见表2)。供试品对照组:取“2.1.”制备的供试液20 ml，加入含有500 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中摇匀过滤，然后用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗5次，每次100 ml，滤干后，取膜接种于含有100 ml胆盐乳糖的培养基中培养，观察。结果(见表2)。

表2 控制菌检查方法验证结果

3 讨论

《中国药典》2005年版规定微生物限度检查法结果判定在3次独立的平行试验中，稀释液对照组及试验组细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证的回收率应不低于70%，低于70%则表明该样品有抑菌作用。控制菌检查方法验证时，阳性对照菌应检出，阴性对照菌不得检出。如验证结果达不到规定，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并对方法重新进行验证。

从以上结果可以看出，该试验方法细菌、霉菌和酵母菌回收率达到《中国药典》2005年版的规定要求，测定结果准确，稳定，说明所建微生物限度检查法可用于硝酸咪康唑乳膏的质量控制。

［1］ 国家药典委员会编.中华人民共和国药典.化工工业出版社，2005.

［2］ 郑钧镛，王光宝.药品微生物学及检验技术.人民卫生出版社，1989.