重组血红蛋白的原核表达、纯化和鉴定＊

杨海波,廖春丽,朱 涛,王莲哲,陈兰英

(河南城建学院生物工程系,平顶山467044)

重组血红蛋白的原核表达、纯化和鉴定＊

杨海波,廖春丽,朱 涛,王莲哲,陈兰英△

(河南城建学院生物工程系,平顶山467044)

目的 利用大肠杆菌表达载体,表达血红蛋白(Hb)基因,并进行纯化及鉴定。方法 将原核表达载体p HE 2-Hb转化入 E.Coli JM109,经 IPTG诱导表达;应用阴离子交换层析、阳离子交换层析分级纯化目的蛋白,用Western blot鉴定纯化出的目的蛋白。结果 SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量约为67 kD,与理论值相一致;应用阴离子交换层析、阳离子交换层析分级纯化目的蛋白,Western blot检测表明得到纯度较高的目的蛋白。结论 利用大肠杆菌表达系统,获得了较高纯度的目的蛋白,为进一步研究 Hb的生物传氧机制研究和以 Hb为基础载氧药物的研究提供重要基础和研究依据,并将为血液替代品和相关疾病的治疗研究奠定研究基础。

血红蛋白;原核表达;纯化

血红蛋白(hemoglobin,Hb)是存在于红细胞中的一种重要血红素蛋白质。血红蛋白分子由4个亚基组成,其中两个为α多肽链,另两个为β多肽链,每个多肽链都含有一个血红素亚基 heme,每个 heme都有一个氧结合部位。其主要功能是携带氧到组织细胞内和清除组织细胞内CO2,维持血液酸碱平衡。对于血红蛋白的研究工作受到国内外相关研究者的重视,已成为国际生物医药生物技术领域研究开发的热点[1-2]。作者通过原核表达、纯化及鉴定,从而为进一步研究血红蛋白的生物传氧机制研究和以 Hb为基础载氧药物的研究提供重要基础和研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料 表达载体p HE2-Hb为本系实验室保存。大肠杆菌工程菌株为大肠杆菌JM109,为本系实验室保存菌株。QIAquick Gel Extraction Kit购自Qiagen公司。氨苄青霉素、DTT、IPTG、丙烯酰胺、N,N甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)均购自华美生物工程公司。Q Sepharose FF和SP Sepharose FF交换柱购自 GE公司。

1.2 重组质粒的诱导表达 将含重组质粒p HE 2-Hb的单个菌落接种于1 mL含氨苄青霉素(100 mg/L)的 TB培养液中,37℃振荡培养至饱和。按1∶20接种量接种饱和培养物到4 mL LB培养基中,于37℃培养约2 h至OD 600约等于0.6。留下诱导前对照样本后,加入 IPTG至终浓度为0.2 mmoL/L,并同时加入 Hemin至终浓度为25μg/mL,37℃继续培养2 h后再次加入 Hemin至终浓度为50μg/mL,培养6 h后收菌,以2×凝胶加样缓冲液50μL悬浮,煮沸10min,离心后取10μL上清液进行15%SDS-PAGE分析。

1.3 蛋白纯化

1.3.1 阴离子交换层析 将收集的菌体破碎后,12 000×g离心30min后,收集上清液并在透析缓冲液中(20 mM Tris-HCl,p H 8.3)透析过夜。将透析后的样品高速离心后进行Q Sepharose FF阴离子交换柱的离子交换吸附。上样后,交换柱由20 mM Tris·HCl溶液(p H 8.3)平衡3～5个柱体积,洗脱至没有基线水平,然后用20 mM Tris·HCl溶液(1 M NaCl,0.2 mM TETA,p H 7.15)梯度洗脱,梯度长度为100 mL,流出液相对洗脱液的盐浓度从0增加到100%,流速为1 mL/min,分管收集目标峰,并进行SDS-PAGE电泳分析。

1.3.2 阳离子交换层析 合并目标蛋白,将上述目标蛋白进行SP Sepharose FF阳离子交换柱的离子交换吸附。交换柱由0.05 mol/L Tris·HCl溶液(含0.1 mol/L尿素,p H 7.2)平衡3～5个柱体积,上样,洗脱至没有蛋白流出,然后用0.05 mol/L Tris·HCl溶液(含0.1 mol/L尿素 +4 mol/L NaCl,p H 7.2)梯度洗脱,梯度长度为100 mL,流出液相对洗脱液的盐浓度从0增加到100%,流速为5 mL/min,收集目标峰,把目标峰过Sephadex G225脱盐柱脱盐,浓缩,冻干。

1.4 Western blot检测 蛋白质样品经SDS-PAGE电泳分离后,取出凝胶,用 PBS漂洗 3次,每次 5min。室温平衡 30min。用半干法转膜,PBS漂洗2次,每次5min。以5%脱脂奶粉室温封闭l h。PBS漂洗3次,每次5min。一抗温室孵育l h。PBST漂洗 4次,每次 5min。二抗温室孵育 l h。用PBST漂洗4次,每次5min。显影、定影并扫描。

2 结 果

2.1 Hb的原核表达 用 IPTG诱导蛋白表达,含 PHE2-Hb质粒的重组菌诱导后在蛋白相对分子质量约15 kD处有明显特异性蛋白条带,与预期大小一致,而空载体菌和未诱导菌均无此特异性表达条带,并同时可以看到共表达的MAP的特异性条带,位于30 kD左右,见图1。.

图1 p HE 2-Hb重组基因的诱导表达

图2 重组血红蛋白的阴离子交换层析图

2.2 Hb的分离纯化 收集的培养菌用裂解缓冲液重悬后,经超声波破碎,4℃,12 000 r/min离心40min,取上清液,利用FPLC系统和阴离子交换层析分离出粗蛋白,在分离过程中可以看到层析柱洗脱的过程中有明显的变红现象。层析图如图2所示,在洗脱过程中出现了3个洗脱峰,分别收集进行SDSPAGE检验,见图3。SDS-PAGE检验结果显示,目标蛋白所在位置为洗脱峰3,浓度较高,但是出现了杂带,收集的洗脱峰3溶液显示明显的红色。

图3 阴离子交换层析收集样品的SDS-PAGE检测

图4 重组血红蛋白的阳离子交换层析图

图5 阳离子交换层析收集样品的SDS-PAGE检测。

图6 诱导表达后的重组 Hb的Western blotting分析

合并洗脱峰3的样品,透析过夜后通过阳离子交换色谱柱进行第2次纯化,直接上样,上样前必须用缓冲液平衡色谱柱,层析图如图4所示,出现了2个主峰和4个小峰。SDS-PAGE检验结果显示,每个峰洗脱的样品都为同一样品,而且样品纯度达到所需要求,见图5。

2.3 Hb的鉴定 Western blott检测结果显示,在37℃条件下,对照组未经IPTG诱导,则未出现 Hb蛋白的表达。而经不同浓度IPTG诱导处理之后,则有不同程度的蛋白表达效果,0.3 mM IPTG诱导时,Hb蛋白表达量较高,随着浓度的增加,0.5 mM IPTG和0.7 mM IPTG诱导时 Hb表达量较0.3 mM IPTG诱导时 Hb表达量略为降低,见图6。

3 讨 论

重组 Hb的设计和纯化制备过程是寻求血液替代品,获得Hb制品的重要手段和重要基础。目前人类 Hb制品基本上分为3类,即化学修饰 Hb、含酶类的人工红细胞和微包囊 Hb、分子遗传工程重组 Hb。随着基因工程和分子生物学技术的迅猛发展,克隆技术的进步深刻影响着人工血液的研究工作,可以借助基因工程手段将rHb经微生物大量繁殖并纯化来大批量生产人 Hb。作为血液替代品,因基因工程可以避免化学修饰、微囊包被 Hb的盲目性和试探性,所以展示出更实用的前景。由于Hb具有高效的载氧能力和维持胶体渗透压的功能,目前国内外都致力于研制以 Hb为基质的携氧剂作为红细胞代用品研究开发的主攻方向。rHb已成为人造血液研究的最新前沿工程和热点领域[3-4]。

Hb具有生物传氧功能,因此以 Hb为基础的载氧药物研究一直是国内外研究的热点之一,该研究可以较好地解决多种疾病如缺血性心脑血管病的供氧问题[5-6]。因此,对载氧药物原料Hb的要求将会越来越高,需要探索更为高效、合理的Hb纯化方法。本文采用Q Sepharose FF阴离子交换柱和SP Sepharose FF阳离子交换柱的离子交换吸附进行分离纯化,得到纯度较高的重组蛋白。

Hb的成功表达和纯化为进一步将更好地了解 Hb的生物传氧机制研究和以Hb为基础载氧药物的研究提供了重要基础和研究依据,并将为血液替代品和相关疾病的治疗研究奠定研究基础。

[1]Chang TMS.Blood substitutes:Principles,methods,products and clinical trials[J].Clin Chem,1998,44:2229.

[2]Abdu l,Alayash.Oxygen therapeutics:Can we tame heamoglobin[J]Nature Rev,2004,3:152.

[3]Winslow RM.Artifieialblood:Aneientdream,modemeniglna[J].Nature Bioteehnol,1998,16:621.

[4]高林,张文博,胡永祥,等.红细胞代用品的临床研究进展[J].中国输血杂志,2004,17(6):486.

[5]Chang TMS.Oxygen carriers[J].Curr Opin Investig Drugs,2002,3:1187.

[6]Robert M,Winslow RM.Blood Substitutes[J].Adv Drug Deliv Rev,1999,40(2000):131

Prokaryotic expression,purification and identification of recombinant hemoglobin＊

YANG Hai-bo,LIAO Chun-li,ZHU Tao,et al.
(Department of Biologic Engineering,Henan University of Urban Construction,Pingdingshan,Henan467044,China)

Objective To construct a prokaryotic expression vector for the expression of hemoglobin to purify and identity.Methods Prokaryotic expression vector p HE 2-Hb was expressed in E.Coli JM109.The expressed protein was identified by SDSPAGE analysis.The target protein was cation-exchange chromatography and anion-exchange chromatography.Results The SDSPAGE showed that the relative molecular mass of this protein was consistent with the predicted value.The protein was expressed in E.Coli JM109 after the prokaryotic expression vector p HE 2-Hb successfully constructed,and the size of the protein was 67 kD,which was consistent with the theoretical data.Conclusion The successfully constructed prokaryotic expression vector p HE 2-Hb,and the purified Hb protein can not only provide an important foundation to the study of more about the oxygen transfer mechanism of Hb,and Hb-based oxygen-carrying drugs,but also provide research proofs to the blood substitutes and the treatment of related diseases.

hemoglobin;prokaryotic expression;purification

10.3969/j.issn.1671-8348.2010.21.016

R331.141;R446.1

A

1671-8348(2010)21-2889-03

国家自然科学基金资助项目(30470877);河南省重点科技攻关项目(092102310006)。△

,E-mail:lychen666@163.com

2010-06-28

2010-08-17)