磷脂酶A 2与高血压大动脉血管重构关系初步研究*

曹相玫,景 丽△,张建中,孙金萍,安 欣,郭凤英

(宁夏医科大学:1.病理系;2.附属医院病理科 银川750004)

高血压细小动脉重构直接影响高血压发生、发展,参与导致靶器官结构和功能损害,研究同时表明,大动脉重构在高血压的发生、发展中也发挥重要作用[1]。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖/凋亡失衡是高血压引起血管重构的主要原因[2]。VSMC增殖/凋亡失衡的机制不清,胞浆型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2,cPLA2)活化后可对细胞的分化和增殖产生调节作用,cPLA2的活化多经丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号转导通路中细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路(Ras/Raf/MEK/ERK)进行[3-4],生理状态下,ERK是M EK的惟一下游底物,MEK和ERK在该通路中具有重要地位。本研究探讨高血压主动脉VSMC中cPLA2的作用以及与ERK 1/2上游激酶MEK的关系,以进一步明确高血压状态下大动脉VSMC增殖/凋亡失衡参与血管重构的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)15只,雄性Wistar大鼠(WKY)15只,均购自北京维通利华实验动物有限公司。单克隆磷酸化兔抗 p-MEK1/2 IgG(Ser2211)抗体(Cell Signaling公司产品),单克隆磷酸化兔抗p-cPLA-2 IgG(P3639 Rb-h)抗体、过氧化物酶标记的链霉卵白素法(streptavidin-biotin-peroxidate complex,SABC)免疫组化染色试剂盒(USCNLIFE公司产品),山羊抗兔IgG-HRP(克隆号:04-15-06,KPL公司),PBS缓冲液、多聚赖氨酸、3,3′-二氨基联苯胺(3,3-diaminobenzidine DAB)试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),预染Marker(兰州TIANGEN公司),Western一抗稀释液、RIPA细胞裂解液(武汉碧云天生物技术有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物 将15只 SHR分为 4、16、24周龄组,15只WYK作为对照。SHR大鼠出厂时经尾动脉仪测量基础血压及心率;所有大鼠均饲养于SP-F级环境中,安静、正常光照、正常饮食。每周同一时间用BL-420E+生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)测大鼠动脉压1次,至周龄处死。于处死前,经腹腔注射3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉后,经股动脉插管连接二导生理记录仪测量动物心率(HR)、动脉收缩压(SAP)、动脉舒张压(DAP)、平均动脉压(MAP)等。迅速取出胸主动脉一半置于DEPC处理后的4%中性多聚甲醛溶液(1∶1 000)中固定48 h,用于免疫组化检测;一半装入冻存管,投入液氮中迅速冷冻后移置于-80℃冰箱中冷冻,用于Western blot测定蛋白含量。

1.2.2 免疫组化法 采用SP法。操作按照产品说明书进行,选择推荐的乳腺癌标本作阳性对照、PBS代替一抗作为阴性对照,DAB显色。

1.2.3 Western-blot检测 按照蛋白质SDS-PAGE电泳操作步骤进行配胶、电泳、DAB染色及采集图像。

1.2.4 结果判断 实验标本均取自胸主动脉,以其冠状切面包埋后切片,随机计数20个高倍视野中的全部 VSMC细胞数,p-cPLA2和p-MEK染色均以胞浆出现棕色或棕黄色颗粒视为阳性细胞。Western blot检测结果经BIO-RAD生物医学图像分析系统对目的显色条带进行光密度分析和扫描半定量分析。观察各实验组泳道膜上棕黑色目的蛋白带密度的灰度并进行统计学分析。

1.3 统计学方法 用SPSS11.5统计软件进行数据统计,两组间血压用t检验,免疫组化阳性率用χ2检验。实验结果以±s表示,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般状况 实验大鼠在实验期间饮食、活动、体质量增长均正常,无动物死亡现象。图1为各组大鼠处死时心脏/体质量趋势图,WKY的体质量均高于同周龄SHR。SHR的心脏/体质量比值均较同周龄WKY的心脏/体质量比值高,并且随周龄增加心脏/体质量比值呈增高趋势。

2.2 血压变化 实验期间,各周龄WKY M AP维持在(106.22±11.52)～(110.60±12.50)mm Hg之间。4周龄SHR血压为(90.25±4.13)mm Hg,8周龄组开始升高,SHR8、SHR16、SHR24明显高于 SHR4和同周龄 WKY,图2为SHR血压随周龄的增加呈升高趋势。

2.3 p-cPLA2检测结果

2.3.1 主动脉VSMC中p-cPLA2免疫组化染色表明p-cPLA2在各组大鼠主动脉VSMC中有不同程度的表达,SHR和WKY均随周龄增加其表达逐渐增强,SHR表达率低于同周龄WKY(表1),差异有统计学意义(P＜0.01)。SHR24阳性细胞少,阳性细胞着色淡,其分布多接近内皮下和外膜下(图3a),而WKY 24主动脉各层VSMC均可见较广泛的表达(图3b)。

2.3.2 主动脉VSMC中p-cPLA 2经Western blot检测未检出,可能由于组织在-80℃冰箱放置时间过长,同时裂解过程处理不当,而组织中p-cPLA2易失去活性,所以经反复实验,Western blot均未检出。

2.4 p-MEK的检测结果

2.4.1 主动脉VSMC中p-MEK免疫组化染色结果 SHR和WKY均随周龄增加其p-MEK表达逐渐增强,SHR表达于同周龄WKY(表2),且差异有统计学意义(P＜0.01,SHR24主动脉中各层VSMC均可见较广泛的表达(图4a),而WKY24表达明显减少,且细胞着色淡,多分布于内皮下和外膜下(图4b)。

2.4.2 p-MEK Western blot检测结果 相对分子质量43 k D附近可见p-MEK蛋白杂交条带(图5),经蛋白条带相对浓度分析显示,随周龄增加SHR主动脉VSMC中p-MEK蛋白相对含量逐渐增高。

表1 主动脉VSMC中p-cPLA 2的表达[个/20HPF,(%)]

表2 主动脉平滑肌细胞中p-MEK的表达[个/20HPF,(%)]

图1 各组大鼠处死时心脏/体质量变化趋势图

图2 各组大鼠血压变化趋势图

图3 主动脉VSMC中p-cPLA 2免疫组化染色(DAB显色,×400)

图4 主动脉VSMC中p-MEK1/2免疫组化染色(DAB显色,×400)

图5 主动脉VSMC中p-MEK1/2 Western blot检测

3 讨 论

高血压时大动脉重构主要表现为管腔扩张,管壁增厚、钙化,病变血管壁中层弹性纤维数量减少、弹性膜断裂,胶原纤维增殖、聚集,弹力纤维与胶原纤维的比例明显下降;弹力膜内的平滑肌细胞肥大、排列紊乱,纤维基质与平滑肌细胞的结合松散,导致大动脉顺应性减退[5]。

临床上,高血压患者主动脉长期受高血压及高应力的影响,顺应性下降,是造成心肌肥厚和心功能不全的重要因素[1]。在高血压患者中,约有1/3会出现左室肥厚,这是心脏对慢性压力和容积超负荷的适应性变化,也是血管重构引起心脏受累的病理表现。本研究证实,SHR从8周龄开始血压明显升高,随周龄增加,SHR血压逐渐升高、心脏/体质量比值也逐渐升高,可能提示高血压状态下主动脉发生重构、顺应性下降,使心脏长期压力负荷增加而造成代偿性肥厚。

磷脂酶A2是一类能水解磷脂sn-22位酯键释放出游离的脂肪酸和溶血磷脂的酯酶超家族[3],分为分泌型、胞浆型和钙离子非依赖型三大类[12],在炎症中发挥重要作用,其中cPLA2可通过磷酸化作用而活化,活化后与细胞的增殖和凋亡有密切的关系[4]。王韻等[7]进行人脐静脉内皮细胞内低密度脂蛋白的研究提示,cPLA2的活化参与了MM-LDL引起的AA释放和人脐静脉内皮细胞凋亡。Panini[8]等研究发现,cPLA2通过钙调蛋白信号转导途径参与25-OHC或氧化修饰低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞和成纤维细胞凋亡。Faghini等[9]研究发现AngⅡ通过活化cPLA2后激活VSMC中Syk(一种72 k D酪氨酸激酶,与生长、分化以及造血和非造血细胞的信号转导相关),促进VSMC分化和增殖,并由 LO促进 AA产生代谢产物。本实验结果显示,各周龄SHR和WKY的主动脉VSMC中p-cPLA2均有表达,且随着大鼠周龄增加,p-cPLA2表达率增加;各周龄SHR表达均比同周龄WKY明显减少,可能提示随着大鼠周龄增加,内外环境的某些刺激因素可激活cPLA2,活化的cPLA2可以诱导大动脉VSMC凋亡,而在高血压状态下,复杂的体内外环境因素使cPLA2对大动脉VSMC凋亡调节减弱,细胞增殖活性相对增强,间质胶原纤维增殖、聚集,使大动脉重构、弹性减退、顺应性下降,而促使SHR心脏肥大、心脏/体质量比值增加。

cPLA2的磷酸化激活主要是通过两条途径,即MAPKs信号转导途径和钙/钙调蛋白激酶信号转导途径,多数细胞经MAPKs信号转导途径中ERK通路活化cPLA2。其整个过程为:通过 Ras→Raf→MEK1/2→ERK 1/2环节中的 Raf蛋白磷酸化cPLA2的两个 MAPKs磷酸化位点(S505和S727)而将其激活,激活cPLA2使其对细胞的分化和增殖产生调节作用[4,6]。Su等[10]研究显示,衣原体吸收甘油磷酸变位酶必须Raf-MEK-ERK-cPLA2信号级联的活化:Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2途径和cPLA2可被衣原体感染活化;cPLA2抑制剂阻断了衣原体摄取甘油磷酸变位酶并降低了衣原体的生长活性;封闭c-Raf-1或MEK 1/2的活性可以阻止衣原体ERK1/2的激活,而阻止了衣原体对宿主细胞cPLA2的活化和甘油磷酸变位酶的释放。Pavicevic等[11]对兔VSMC进行在体研究显示,cPLA2通过ERK 1/2途径被丝氨酸-505(S505)磷酸化而激活。

本实验结果显示,各周龄SHR和WKY的主动脉VSMC中p-MEK均有表达,且随着大鼠周龄增加,p-M EK阳性表达增加;SHR比同周龄WKY表达均明显增高。与之相反,SHR p-cPLA2表达与同周龄WKY相比均明显减少。提示MEK的激活与cPLA2活性减弱可能共同参与了高血压大动脉血管重构的发生、发展。

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