原料乳中三聚氰胺和β-内酰胺酶检测快速筛选法与确证方法比对研究

罗 祎,宋 洋,薛晓晶,舒翠莉,田世民,仲维科

(1.中国检验检疫科学研究院综合检测中心,北京100123; 2.爱德士缅因生物制品贸易(上海)有限公司,上海200336)

原料乳中三聚氰胺和β-内酰胺酶检测快速筛选法与确证方法比对研究

罗 祎1,宋 洋1,薛晓晶1,舒翠莉2,田世民1,仲维科1

(1.中国检验检疫科学研究院综合检测中心,北京100123; 2.爱德士缅因生物制品贸易(上海)有限公司,上海200336)

目的 对原料乳中三聚氰胺检测的液质确证方法与快速筛选方法进行比对验证。方法 SNAP双流向酶联免疫法快速检测还原乳中的三聚氰胺。结果 其最低检出限达到0.10 mg/kg,还原乳中三聚氰胺浓度与SNAP读数仪读数呈显著正相关(r2=0.986)。同时通过对原料乳中β-内酰胺酶加标试样的比对快速筛选方法与微生物法(杯碟法)完全相符,且二者最低检出限均可达到0.000 25 IU/mL。结论 双流向酶联免疫法可以用于原料乳中非法添加的三聚氰胺和β-内酰胺酶的快速筛选,其检测速度和灵敏度均能满足奶户、奶站、乳品厂和部分实验室的快速筛选检测,但是其使用目前还仅限于原料乳或原料乳粉。

三聚氰胺;β-内酰胺酶;检测方法

为保障消费者的身体健康,保持乳品行业的健康发展,建立牛乳制品中三聚氰胺、β-内酰胺酶的快速、准确和行之有效的检测方法是十分必要的。

1 材料与方法

1.1 材料 藤黄微球菌(micrococcus luteus)CMCC(B)28001 (购自国家医学菌种保藏管理中心),在营养琼脂上传代培养备用。实验用10 U青霉素药敏纸片(购自北京天坛药物生物技术开发公司);乙酸、乙酸铵等(购自北京试剂公司);舒巴坦、青霉素G(购自中国药品生物制品检定所);β-内酰胺酶标准品(1 k IU)(购自Sigma公司);三聚氰胺、β-内酰胺酶SNAP双流向酶联免疫试剂盒[购自爱德士缅因生物制品贸易(上海)有限公司]。

1.2 仪器 液相色谱-质谱/质谱仪(LC-M S/M S)(Agilent 6410);SNAP加热器(北京安普公司);SNAPDSR读数仪[爱德士缅因生物制品贸易(上海)有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 还原乳配制 称取235.3 g工业奶粉(经LC-MS/MS确证为无三聚氰胺,无β-内酰胺),溶解于2 000 mL温水中;三聚氰胺还原乳试样的配制:取100 mg/kg三聚氰胺标准保存液(本实验室配制并经LC-M S/M S确认浓度为100 mg/kg)各0、0.1、0.3、1、2、2.5 m L,分别加入100 mL还原乳中,配制为各含0.0、0.1、0.3、1.0、2.0、2.5 mg/kg的还原乳试样。β-内酰胺酶还原乳试样的配制:将Sigma的青霉素酶1 k IU溶于1 m L缓冲液中(0.1 mol/L Tris HCl,p H 7.0,含有0.1% BSA)得到1 000 IU/mL的青霉素酶。取10 L 1 000 IU/mL的青霉素酶加入1 m L还原乳中配制成10 IU/mL的青霉素酶,再取10 L 1 000 IU/m L的青霉素酶加入1 mL还原乳中配制成0.1 IU/mL的青霉素酶;取0.1 IU/mL的青霉素酶各0、0.25、0.5、1 mL,分别加入100 mL还原乳中,配制为各含0、0.000 25、0.000 5、0.001 IU/mL的还原乳试样。

1.3.2 液相色谱-质谱/质谱法检测还原乳中三聚氰胺含量,参照GB/T 22388-2008原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法。

1.3.3 SNAP双流向酶联免疫法快速检测还原乳中的三聚氰胺 按试剂盒说明书操作,用配套吸管吸取45 050 L待检奶样滴入装有冻干试剂的试管中,充分晃动混匀,在预热到(45± 5)℃的加热器上孵育样品2 min,将样品管中的所有液体倒入SNAP样品孔中后。倒入的样品孔中的样品会流向蓝色的激活圈。当蓝色的激活圈开始消失时,快速而有力的压下操作键直至其与SNAP盒体齐平。当操作正确时会听到清晰的“啪”的声音。保温至少7 min。读数仪读数大于1.05为阴性;读数仪读数小于1.05为阳性。

1.3.4 杯碟法检测还原乳中β-内酰胺酶

1.3.4.1 加样 取待检还原乳样品,按表1顺序加入终浓度为0.5 g/mL青霉素G、25 g/mL舒巴坦和0.5 IU/L的阳性对照用β-内酰胺酶,并将表1中A～D试样各200μL放置于加有藤黄微球菌的同一抗生素检测用培养基上的4个8 mm钢管中,37℃培养18～22 h,测量抑菌圈直径。每个试样重复测试3遍后取平均值,同时做牛奶试样的空白对照、25 g/mL舒巴坦对照,见表1。

1.3.4.2 牛奶试样中β-内酰胺酶检测结果判定 (1)如果待检还原乳试样空白对照在加有藤黄微球菌的抗生素检测用培养基上出现抑菌圈,说明该试样中含有抗菌物质。(2)25μg/ mL舒巴坦对0.5 g/mL青霉素G的抑菌作用没有影响;同时25 g/m L舒巴坦可有效抑制0.5 IU/Lβ-内酰胺酶阳性对照样品对0.5 g/mL青霉素G的分解作用。(3)在待检还原乳试样中,如果添加0.5 g/mL青霉素G的抑菌圈与添加0.5 g/mL青霉素G和25 g/mL舒巴坦试样的抑菌圈差异在3 mm以上(含3 mm),且重复性良好,应判定该试样添加有内酰胺酶。(4)在待检还原乳试样中,如果添加0.5 g/mL青霉素G试样的抑菌圈与添加0.5 g/m L青霉素G和25 g/mL舒巴坦试样的抑菌圈差异在3 mm以下(不含3 mm),且重复性良好,应判定在该试样品未检出β-内酰胺酶。(5)经测试,本方法在牛奶试样中对β-内酰胺酶的检出限为0.5 IU/L。

表1 杯碟法加样方法

1.3.5 SNAP双流向酶联免疫间接法快速检测还原乳中的β-内酰胺酶 按试剂盒说明书操作将1 m L或1.5 mL待检还原乳奶样加入β-内酰胺酶检测试剂瓶中,充分混匀溶解试剂瓶中的干燥粉剂。将加入样品后的β-内酰胺酶试剂瓶置于加热器上(45±5)℃、(113±9)°F孵育20 min,然后于室温下放置10 min,β-内酰胺酶SNAP操作步骤进行检测。用配套吸管吸取(450±50)μL试剂瓶中奶样滴入装有冻干试剂的试管中,充分晃动混匀,在预热到(45±5)℃的加热器上孵育样品5 min,将样品管中的所有液体倒入SNAP样品孔中后。倒入的样品孔中的样品会流向蓝色的激活圈。当蓝色的激活圈开始消失时,快速而有力的压下操作键直至其与SNAP盒体齐平。当操作正确时会听到清晰的“啪”的声音。保温至少4 min。读数仪读数大于1.05为β-内酰胺酶阴性;读数仪读数小于或等于1.05为β-内酰胺酶阳性。

1.4 统计学方法 统计学方法采用SPSS13.0统计软件。

2 结 果

2.1 液相色谱-质谱/质谱法检测还原乳中三聚氰胺含量 该方法检出限为0.01 mg/kg,经确认所配置的含三聚氰胺还原乳试样中三聚氰胺实际浓度分别为0.00、0.10、0.27、0.89、1.72 mg/kg和2.37 mg/kg。

2.2 SNAP双流向酶联免疫法快速检测还原乳中的三聚氰胺还原乳中不含三聚氰胺时,20次SNAP检测读数均小于1.05,均为阴性结果;当还原乳中含有0.10 mg/kg的三聚氰胺时,20次SNAP检测均小于1.05为阴性结果,但读数均较不含三聚氰胺组明显增加,其差异有统计学意义(P<0.01);当还原乳中含有0.27、0.89、1.72、2.37 mg/kg的三聚氰胺时,20次SNAP检测读数均大于1.05全部为阳性结果,与不含三聚氰胺组比较差异有统计学意义(P<0.01),见表2;另外,0.00、0.10、0.27、0.89、1.72、2.37 mg/kg各组间的读数差异有统计学意义(P<0.01)。还原乳中三聚氰胺浓度与SNAP读数仪读数呈正相关关系,见图1。

表2 SNAP双流向酶联免疫法快速检测还原乳中的三聚氰胺(mg/kg)

图1 三聚氰胺浓度与SNAP读数仪读数

2.3 杯碟法检测还原乳中β-内酰胺酶 经杯碟法检测表明所配制的各含0.000 25、0.000 5、0.001 IU/m Lβ-内酰胺酶的还原乳试样均为β-内酰胺酶阳性检出,见封2图2。

2.4 SNAP双流向酶联免疫间接法快速检测还原乳中的β-内酰胺酶 还原乳中0 IU/mLβ-内酰胺酶时,15次SNAP检测读数均大于1.05,均为阴性结果;当还原乳中含有0.000 25 IU/mLβ-内酰胺酶时,15次SNAP检测中6次读数大于1.05为阴性,9次读数小于1.05为阳性;当还原乳中含有0.000 5 IU/mL和0.001 IU/mLβ-内酰胺酶时,各组的15次SNAP检测读数均小于1.05,均为阳性结果,见表3。

表3 SNAP双流向酶联免疫间接法快速检测还原乳中的β-内酰胺酶

3 讨 论

3.1 2008年10月8日,中国卫生部等5个部门联合发布公告,制定三聚氰胺在乳与乳制品中的临时管理值:要求婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1 mg/kg;液态奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg;含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg。在三鹿婴幼儿奶粉事件发生后,国家标准化管理委员会制定了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》国家标准。标准规定了高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱/质谱法3种方法为三聚氰胺的检测方法,检测定量限分别为2、0.05和0.01 mg/kg。上述方法均为定量的确证方法,其可以普遍使用于各类检测实验室,对于奶户、奶站、乳品厂和不具备大型检测仪器的实验室可以选用适宜的快速筛选方法。通过本次实验验证,SNAP双流向酶联免疫法快速检测还原乳中的三聚氰胺,当还原乳中三聚氰胺浓度达到0.27 mg/kg时, SNAP双流向酶联免疫法能够检出所有阳性样品,其最低检出限能够达到0.10 mg/kg,符合目前大部分乳品厂对原料奶三聚氰胺含量在0.3 mg/kg以下的控制要求,还原乳中三聚氰胺浓度与SNAP读数仪读数呈显著正相关关系(r2=0.986)。因此,采用筛选方法检测乳品中三聚氰胺,当检到阳性或可疑样品后,再用液相/质谱或气相/质谱方法确认,从而节约大量的时间和人力。

3.2 目前国际上尚无牛奶中β-内酰胺酶的标准检测方法,而市面上的抗生素分解剂原液中的β-内酰胺酶浓度均在每毫升微克级[1],而其推荐在牛奶中1∶1 000 000稀释使用,这一低使用浓度限制了β-内酰胺酶直接检测方法的使用,如酶联免疫方法、高效液相色谱法及蛋白杂交等方法。尽管多种微生物可以产生β-内酰胺酶,但到目前为止还没有在无人为添加β-内酰胺酶的牛奶中检出β-内酰胺酶的报道[2]。究其原因可能是由于采奶方式、牛奶的组分、消毒方法和包装储存方法等不适于产β-内酰胺酶微生物的生存,基于目前已有的知识,应认为牛奶中检出的β-内酰胺酶是人为添加的。为了应对这一特殊情况的出现,本实验室按卫生部推荐的微生物法(即杯碟法)检测牛奶中β-内酰胺酶,经长时间的反复摸索实验条件和验证,最终建立了稳定、可靠的β-内酰胺酶微生物法(杯碟法)检测方法,最低检出限达到0.000 25 IU/mL,灵敏度为0.000 5 IU/ m L。该方法可用于确认乳制品中β-内酰胺酶的存在。同时SNAP双流向酶联免疫间接法快速检测还原乳中的β-内酰胺酶,并平行比较微生物(杯碟法)和SNAP间接法的精确度和灵敏度,结果表明二者的检出下限均可达到0.000 25 IU/mL。因此采用快速筛选法进行筛选,阳性或可疑样品再使用微生物(杯碟法)进一步确认。

[1]崔生辉,李景云,马越,等.“生鲜牛乳抗生素分解剂”的鉴定与检测[J].中国食品卫生杂志,2007,19(2):113.

[2]Samaha-Kfoury JN,A raj GF.Recent developments inβlactamases and extended spectrumβ-lactamases[J].BMJ, 2003,327(7425):1209.

book=21,ebook=289

10.3969/j.issn.1671-8348.2010.21.053

R446.61;R155.57

B 文献标识码:1671-8348(2010)21-2967-03

2010-03-24)