缺血性脑损伤中大鼠海马CA1区热休克相关因子变化的研究*

宋远见,刘红芝,温相如,刘永民

(徐州医学院:1.基础学院;2.公共教育学院,江苏 221004)

缺血性脑损伤常因脑血液循环障碍所致,患者常表现为猝然昏扑、不省人事或突然发生口歪眼斜、舌强言蹇、半身不遂、智力障碍等临床特征。据报道,每年约460万人死于脑卒中,其中约86%因缺血所致。因此,积极探索缺血性脑损伤中所涉及关键因子的状况,具有极其重要的医学价值。热休克蛋白72(heat shock proteins72,HSP72)是HSP家族中最重要的成员,也是应激诱导表达最多的成员。作为重要的分子伴侣,HSP72能够结合各种变性蛋白,以防这些蛋白遭受免疫细胞的攻击[1],因此HSP72对维持细胞稳态和细胞存活具有重要意义。本实验以大鼠双侧颈总动脉结扎脑缺血动物模型为基础,研究HSP72 mRNA和HSP72蛋白在缺血再灌注不同时期的表达情况,可望为进一步探讨HSP72在缺血性脑损伤中的作用机制提供可靠的实验基础。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 雄性健康SD大鼠80只,体质量为250～300 g,均为清洁级。将大鼠随机均分为甲、乙两组,甲组用于检测HSP72 mRNA的表达,乙组用于检测HSP72蛋白的表达。甲、乙每个组又分别分为 8组,即假手术组(Sham)、缺血再灌注30 min组(I/R30 min)、缺血再灌注3 h组(I/R3 h)、缺血再灌注12 h组(I/R12 h)、缺血再灌注1 d组(I/R1 d)、缺血再灌注3 d组(I/R3 d)、缺血再灌注 5 d组(I/R5 d)和缺血再灌注7 d组(I/R7 d),每组5只。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备 腹腔注射20%水合氯醛(300～350 mg/kg)麻醉动物后,分离双侧颈总动脉并以宽松绳线套住但不结扎,电凝双侧椎动脉[2-3]。手术第2天在动物清醒状态下结扎双侧颈总动脉,全脑缺血15 min,然后再灌注不同的时间。缺血时保持直肠温度为36.5～37.5℃。假手术组实施与实验组相同的处理,但不结扎双侧颈总动脉。

1.2.2 样品制备和免疫印迹检测 甲组参照Nikaido等[4]使用的方法,使用Trizol试剂盒抽提样品中总RNA,使用 RTPCR试剂盒进行检测,引物序列为:5′-CCG GAG AGA AGG AGT AAC TTG ATA AG-3′,5′-TGG ATT AGA GGC TTT TCT GGC TC-3′。以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参照,引物序列为 :5′-TGA ACA CGG CAT TGT AAC CAA C-3′,5′-CAG TGG TACGAT GTA ACC AAC-3′。扩增产物经2%琼脂糖电泳,利用Sensiansy凝胶图像分析软件进行拍照并进行电泳图像分析。以I/R3 h组为基准(假设为1),其余各组与之相除所得比值见表1。

表1 海马CA1区HSP72 m RNA表达情况(±s)

表1 海马CA1区HSP72 m RNA表达情况(±s)

检测指标 Sham I/R30 min I/R3 h I/R12 h I/R1 d I/R3 d I/R5 d I/R7 d HSP72 m RNA 0.12±0.12 0.25±0.13 1 1.51±0.23 2.34±0.15 5.66±0.19 3.13±0.24 1.89±0.17

乙组于大鼠快速断头取脑后,分离出双侧海马CA 1区,置液氮中冻存。下面步骤中的操作均在冰水浴中实施。由液氮中取出海马CA1区,注入1.5 mL内含蛋白酶抑制剂的匀浆缓冲液,匀浆(10 s×6次)后,800×g离心 10 min,弃去上清液,加入0.6 m L buffer B振荡摇匀,12 000×g离心10 min,取上清液,按改良Lowry法,用牛血清清蛋白作为标准蛋白测蛋白后分装,置于-80℃冰箱备用。按宋远见等[5]的方法,等量蛋白样品经7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后,电转移至NC膜上。转移后的NC膜经3%BSA室温封闭3 h后加入HSP72一抗,4℃过夜。用洗涤缓冲液洗膜3遍,加入二抗IgG,37℃孵育2 h,再用洗涤缓冲液洗膜3遍。用NBT/BCIP显色,双蒸水冲洗以终止反应。结果用图像处理仪(Gene Company)分析处理。

1.3 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件,所得数据以±s表示,组间比较采用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

HSP72 mRNA表达见表1,HSP72蛋白表达见图1。

图1 海马CA 1区HSP72蛋白表达情况

3 讨 论

HSP72是HSP家族中最重要的成员,也是应激诱导表达最多的成员。正常情况下,HSP72主要位于细胞浆中,当细胞遭受感染或氧化应激时,HSP72有一部分向细胞核内移位,发挥细胞保护和免疫调节作用[6]。有研究发现,H2O2和HS(heat shock)等刺激能够促进巨噬细胞HSP72发生核移位,核聚集的HSP72能够与多种核蛋白发生相互作用,随着刺激时间延长,HSP72又能够回到细胞浆中[7]。HSP72中存在一个重要结构域即PBD结构域,通过该结构域HSP72能够与蛋白激酶C和JNK1、Akt等多种蛋白结合,进而发挥生物学功能。另外,该结构域可以通过基因重组方法去除,从而影响HSP72的功能,但并不影响HSP72的核移位[8-9]。作为重要的分子伴侣,HSP72能够结合各种变性蛋白,以防这些蛋白遭受免疫细胞的攻击[10],因此HSP72对维持细胞稳态和细胞存活具有重要意义。

以SD大鼠脑缺血模型为基础研究HSP72 mRNA和蛋白的表达时间窗,是研究缺血性脑损伤中热休克作用机制的重要实验基础。本研究结果显示,HSP72 mRNA和蛋白在假手术组和缺血再灌注早期没有表达,从再灌注3 h开始有少许表达,至再灌注3 d表达量达到最高峰,随之渐渐下降。这一结果初步提供了HSP72 mRNA和蛋白在缺血性脑损伤过程中表达的时间趋势,可望为进一步研究热休克作用的相关机制提供一定的依据。

[1] Hartl FU.Molecular chaperones in cellular protein folding[J].Nature,1996,381(6583):571.

[2] 宋远见,刘红芝,裴冬生,等.Akt信号通路介导脑缺氧缺血后丰富环境对幼鼠海马神经元的影响[J].江苏医药,2009,35(3):299.

[3] 宋远见,刘红芝,裴冬生,等.缺氧缺血性脑损伤后丰富环境刺激对大鼠海马CA 1区神经元凋亡的影响[J].第三军医大学学报,2008,30(22):2119.

[4] Nikaido H,Tsunoda H,Nishimura Y,et al.Potential role for heat shock protein 72 in antagonizing cerebral vasospasm after rat subarachnoid hemorrhage[J].Circulation,2004,110(13):1839.

[5] 宋远见,刘红芝,裴冬生,等.一氧化氮对大鼠脑缺血再灌注后 JNK3、Bad(ser128)和c-Jun磷酸化的影响[J].中国现代医学杂志,2009,19(12):1817.

[6] Cowan KJ,Diamond MI,Welch WJ,et al.Polyglutamine protein aggregation and toxicity are linked to the cellular stress response[J].Hum Mol Genet,2003,12(12):1377.

[7] Lee WC,Wen HC,Chang CP,et al.Heat shock protein 72 overexpression protects against hyperthermia,circulatory shock,and cerebral ischemia during heatstroke[J].JAppl Physiol,2006,100(6):2073.

[8] Mariucci G,Tantucci M,Giuditta A,et al.Permanent brainischemia induces marked increments in HSP72 expression and local protein synthesis in synapses of theischemic hemisphere[J].Neurosci Lett,2007,415(1):77.

[9] Gao T,Newton AC.The turn motif is a phosphorylation switch that regulates the binding of HSP70 to protein kinase C[J].JBiol Chem,2002,277(35):31585.

[10]Hartl FU.Molecular chaperones in cellular protein folding[J].Nature,1996,381(6583):571.