一株链霉菌菌株选育及其抑菌活性物质研究

朱 立, 叶 明, 刘 冬, 范治均, 杨招娣

(合肥工业大学 生物与食品工程学院,安徽 合肥 230009)

0 引 言

链霉菌是微生物中产抗生素最多的种属,很早就被开发利用的有抗细菌、抗真菌和抗肿瘤活性的各种抗生素。抗生素在临床上不但可以控制若干由病原细菌和真菌引起的疾病,作为治疗恶性肿瘤的药物[1],在防治农作物的病、虫、草害上抗生素也得以广泛地应用[2]。由于野生菌株的生产能力很低,限制了它的发展和利用,目前提高抗生素效价及其生产能力的主要方法有:组合生物合成[3]、诱变育种获得高产菌株[4]和优化发酵条件等。

链霉菌YH-2是从采自全国8个不同省份28份不同环境的土壤样品中分离出的一株具有较强抑菌活性的菌株,该菌株及其发酵液对细菌具有较强的抑制作用。本文研究通过对链霉菌YH-2进行紫外、微波和DES诱变及其培养条件优化,以提高菌株抑菌活性,为链霉菌资源的开发与利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

(1)菌株。链霉菌YH-2,合肥工业大学微生物资源与应用研究室分离保藏菌株。

(2)培养基。见参考文献[5]。

1.2 方 法

(1)抗生素发酵。将链霉菌YH-2斜面孢子用无菌水洗下,摇匀,取0.2 mL孢子悬液均匀涂布于高氏一号固体培养基上,28℃培养96 h。用直径为2 mm打孔器接菌块于种子培养基,28℃、200 r/min震荡培养24 h,以10%的接种量接入发酵培养基中,28℃、200 r/min震荡培养144 h;将发酵液离心(5000 r/min,10 min),取上清液备用。

(2)抑菌活性的测定。以金黄色葡萄球菌为指示菌,采用管碟法测定抑菌活性,3个重复。

(3)诱变。制备108个/mL的单孢子菌悬液。

微波诱变[4]:选用微波频率2 450 MHz,功率600 W。将10 mL菌悬液置于微波炉中,分别辐射 10 、20、30、40、50 、60 s,然后稀释 104倍后涂平板,3个重复。

紫外诱变(UV)[4]:取10 mL孢子悬液于培养皿中,磁力搅拌,于25 W紫外线下30 cm处分别照射 10 、20 、30 、40、50、60、70、80 、90 s,然后红光下稀释104倍后涂平板,3个重复。

硫酸二乙酯诱变(DES)[6]:取10 mL孢子悬液至无菌三角瓶内,加2%硫酸二乙酯0.1 mL,分别振荡处理30～70 min,然后稀释104倍后涂平板,3个重复。

(4)培养条件的优化。以碳源、氮源、发酵温度、起始pH 和接种量为因素分别用A、B、C、D、E表示,选取L25(56)正交表进行发酵条件优化。

(5)效价测定。以金黄色葡萄球菌为试验菌,青霉素钠为标准品,采用二剂量法[7]测定发酵液效价。

(6)抑菌物质的提取与鉴定[8]。取30 mL上清液,分别用正丁醇、乙酸乙酯、氯仿-甲醇(1∶1)、氯仿以1∶1的体积比萃取,萃取3次,合并萃取相。粗提物的鉴定采用普鲁士蓝法[9]。

(7)抑菌物质稳定性测定[10]。热稳定性试验分别取发酵液l0 mL于30～100℃恒温水浴30 min,待自然冷却后测定抑菌活性;酸碱稳定性试验分别取发酵液l0 mL调节pH 2～11,测定抑菌活性。

(8)最低抑菌质量浓度(MIC)测定。取直径为15 mm试管11支,分别加入含质量浓度为1 092、546、273、136.5、68.3、34.2、17.1、8.6、4.3、2.2 、0 μ g/mL 抗生素的牛肉膏蛋白胨液体培养基2 mL,向每管加入106个/mL金黄色葡萄球菌菌悬液0.1 mL,37℃培养24 h,无菌生长的药物质量浓度即为MIC。

2 结果与讨论

2.1 突变菌株的筛选

链霉菌YH-2的3种诱变效应如图1～图3所示,菌株YH-2微波诱变 30 s其致死率达到93.8%,紫外诱变处理 80 s其致死率达到78.12%,DES处理60 min其致死率为77.5%。诱变处理后选择不同诱变剂量下透明圈和菌落直径比值最大的菌株进行发酵。

由图1～图3可以看出,不同诱变处理获得的突变株其发酵液抑菌活性最强者分别出现在微波40 s处、紫外20 s处和DES 60 min处,其中紫外20 s处菌株发酵液的抑菌活性最高,其抑菌圈直径为32.43 mm。其菌株编号为链霉菌YH-UV-2。

图1 微波诱变效应曲线图

图2 紫外诱变效应曲线图

图3 DES诱变效应曲线图

2.2 发酵条件优化

以菌株YH-UV-2为实验对象,选取L25(56)正交表进行发酵条件的优化,其试验方案与结果见表1所列。

表1 正交试验方案与结果

由表1极差R值可以判断因素A为抑菌物质产生的主要影响因素,其他各因素对抑菌物质的产生影响程度顺序如下:D＞E＞C＞B,可以确定最佳组合条件为A2C4D4E3B4,即2%葡萄糖,1%酵母膏,0.05%K2HPO4◦3H2O,0.05%NaCl,0.05%MgSO4◦7H2O,0.001%FeSO4◦7H2O,32℃,pH 7.6,接种量为8%。由二剂量法测得标准曲线回归方程为:

其中,Y为效价(104U/mL);X为抑菌圈直径。测得其效价为61 703 U/mL,比原始菌株发酵液效价47 314 U/mL提高了30.41%。

2.3 抑菌物质稳定性

温度对抑菌物质活性的影响,如图4所示,在30～100℃范围内菌株所产抑菌物质具有良好的热稳定性。pH对抑菌物质活性的影响,如图5所示,当pH≤8时,该抑菌物质具有较好的抑菌作用,但pH＞8时无抑菌作用,表明该抑菌物质在pH≤8时具有较好的稳定性。

图4 温度对抑菌物质活性的影响

图5 pH对抑菌物质活性的影响

2.4 抑菌物质的提取

由表2所列可知不同溶剂萃取相抑菌活性:氯仿-甲醇＞正丁醇＞乙酸乙酯＞氯仿,萃余相:氯仿＞氯仿-甲醇＞正丁醇＞乙酸乙酯,可能是各有机溶剂所萃取的成分不同导致,采用氯仿-甲醇进行提取,最终获得红褐色粗提物27.3 mg。根据普鲁士蓝显色反应可知,该物质为多酚类化合物,该化合物具有邻位酚羟基结构。

表2 各有机溶剂提取液抑菌活性

2.5 最低抑菌质量浓度(MIC)

由于不同质量浓度的抑菌物质对受试菌的抑制作用不同,在达到一定质量浓度后才表现出抑制作用。结果表明,1～5管培养液澄清,无细菌生长,故选择第 5管的质量浓度68.3 μ g/mL为MIC。

3 结束语

目前,尽管利用基因工程的方法[11]在抗生素的菌种选育上有些成功的报道,但是经典的诱变育种仍是主要的育种手段。本文采用微波、紫外、硫酸二乙酯3种诱变方式对菌株YH-2进行诱变选育,结果表明紫外诱变效果最佳。将获得的高产突变菌株YH-UV-2经优化培养基发酵,其效价较原始发酵培养基提高了30.41%,说明培养基成分对抗生素的产量具有调控作用。

不吸水链霉菌黄山变种2-16[12]是近年来报道的发酵液效价较高的菌株,其效价为8 952 U/mL。本研究获得链霉菌YH-UV-2菌株发酵液效价为61 703 U/mL,为其 6.89倍。因此,本研究诱变选育的YH-UV-2菌株具有较高的开发应用价值,有望成为抗生素的生产菌种。

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