骨肽注射液细菌内毒素定量检查法探讨

2010-10-18山西省长治市药品检验所046000舒玉萍王美云

首都食品与医药 2010年6期

山西省长治市药品检验所（046000）舒玉萍王美云

骨肽注射液收载于《国家药品标准》（化学药品地方标准上升国家标准第十六册），标准规定其热原检查法为家兔法。但由于家兔法操作繁琐，灵敏度低，不能检测内毒素的含量，而定量法鲎试验可进行灵敏而准确的内毒素定量检测。按照《中国药典》2005年版附录收载的方法，采用动态浊度法建立骨肽注射液细菌内毒素检查方法。

1 材料和仪器

细菌内毒素工作标准品（批号为150601-200859，效价为120EU·支-1，中国药品生物制品检定所）；鲎试剂（批号为0708310，规格为1.25ml，湛江安度斯生物有限公司）；细菌内毒素检查用水（批号为050401，规格为5ml，湛江海洋生物制品厂）；骨肽注射液（批号为090501，吉林省辉南辉发制药股份有限公司；批号为090130、090745，蚌埠宏生生化制药厂；规格均为2ml：10mg）。BET-32M型细菌内毒素测定仪（天津大学无线电厂），XW-80A旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；反应器皿均经250℃2h干热灭菌。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值的确立[1]按公式L=K·M-1计算，K为按规定的给药途径，即人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，静脉注射药品为5EU·（kg·h）-1，M为人用每公斤体重每小时最大给药剂量。骨肽注射液在临床上成人一次最大给药剂量为20ml[2]，人均体重按60kg计算，因此计算出L=15EU·ml-1；最大的有效稀释倍数MVD=cL·λ-1（动态浊度法鲎试验：λ为标准曲线最低点浓度，λ=0.03125EU/ml，c=1ml·ml-1，MVD=480）。

2.2 实验方法

2.2.1 标准曲线的制作及可靠性细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品溶解，在漩涡混合器上混合15min后，再用细菌内毒素检查用水进行稀释，使内毒素终浓度分别为2.00、0.50、0.125、0.03125 EU·ml-1，每一步稀释都在漩涡混合器上混合30s。各取0.3ml分别加入到预先加有0.1ml鲎试剂的反应管中，混合均匀，插入BET-32M型细菌内毒素测定仪进行检测。每一浓度平行作3管，同时作阴性对照2管。实验数据按最小二乘法进行统计运算，其标准曲线为LgT=2.9437－0.1300LgC，r=－0.998。其中，相关系数|r|=0.998>0.980，平行管的CV<10%，阴性对照在检测线之外，故标准曲线有效。检测结果见附表1。

2.2.2 干扰试验骨肽注射液最大的有效稀释倍数为480。将090501批样品制备成10、20、40、80倍的浓度系列，每个浓度分别取0.2ml样品加0.1ml鲎试剂作为样品检查（S）；另外制备上述5个浓度含内毒素0.5 EU·ml-1的系列，每个浓度分别取0.2ml加0.1ml鲎试剂作为样品阳性对照（PPC）。将溶液分为两组，每一浓度平行作2管，同时作阴性对照2管和阳性对照（0.5EU·ml-1）2管，插入BET-32M型细菌内毒素测定仪进行检测。干扰预试验结果见附表2。结果显示，骨肽注射液10、20倍稀释液对鲎试剂凝集反应具有增强作用，经40倍、80倍稀释的回收率均在50%～200%，经40倍稀释的回收率最接近100%且稀释级低于80倍，因此可选择样品40倍稀释的浓度作为日常检查用。

附表1 标准曲线的可靠性

附表2 骨肽注射液干扰预试验

附表3 骨肽注射液干扰试验

为验证骨肽注射液40倍稀释浓度的有效性，进行了3个批号的骨肽注射液正式干扰试验，以样品40倍稀释的浓度分别取0.2ml样品加0.1ml鲎试剂作为样品检查（S），另制备含内毒素0.5EU·ml-1的40倍稀释样品，分别取0.2ml加0.1ml鲎试剂作为样品阳性对照组（PPC），将溶液分为两组，每一浓度平行作2管，同时作阴性对照和阳性对照（0.5EU·ml-1）各2管，插入BET-32M型细菌内毒素测定仪进行检测，干扰试验结果见附表3。结果表明，3个批号的骨肽注射液40倍稀释浓度添加内毒素的干扰试验回收率均在50%～200%，对鲎试验无干扰作用。

2.2.3 对比试验通过对三个批号的骨肽注射液进行检查，并且与热原检查结果对比，均符合规定，表明定量检查和热原检查结果相吻合。