交替假单胞菌LP621菌株产右旋糖苷酶的培养条件优化

吕明生,王淑军＊,房耀维,焦豫良,刘 姝,张 露,吴彬彬

(1.淮海工学院海洋学院,江苏连云港 222005;2.江苏省海洋资源开发研究院,江苏连云港 222001)

交替假单胞菌LP621菌株产右旋糖苷酶的培养条件优化

吕明生1,2,王淑军1,2＊,房耀维1,2,焦豫良1,2,刘 姝1,2,张 露1,吴彬彬1

(1.淮海工学院海洋学院,江苏连云港 222005;2.江苏省海洋资源开发研究院,江苏连云港 222001)

从江苏连云港海域分离和筛选到1株产右旋糖苷酶的海洋细菌交替假单胞菌Pseudoalterom onas tetraodonisLP621,通过单因素试验和正交试验对该菌株产右旋糖苷酶培养条件进行优化。单因素试验结果表明,最佳培养时间为24 h,最适产酶温度为25℃;产酶pH范围为5.0～11.0,最适产酶pH为6.0;产酶NaCl浓度范围为1%～10%,NaCl浓度为4%时产酶较高;装液量在25%。麦芽糖、胰蛋白胨和酵母膏促进产酶。利用响应面方法对LP621产右旋糖苷酶的发酵条件进行优化。选择培养基pH、时间、麦芽糖浓度和装液量4因素进行优化,结果为pH 7.07,发酵时间21.94 h,麦芽糖浓度0.42%,装液量为21.88%,酶活为270.1 U/mL。

右旋糖苷酶;交替假单胞菌属;优化

右旋糖苷酶(Dextranase,α-D-1,6-Glucan-6-DGlucanohydrolase,EC3.2.1.11),又叫α-葡聚糖酶,是专一切割右旋糖苷(Dextean)中α-1,6糖苷键的水解酶[1]。右旋糖苷酶在龋齿防治、制糖工业和药用右旋糖苷的生产中具有重要作用[2]。丹麦Novo公司、美国Miles公司等都有商品右旋糖苷酶制品出售,在国内此项工作开展甚少,也无该酶制剂的生产。目前国内外报道的产右旋糖苷酶微生物主要为青霉(Penicillium)[3]、斯达油脂酵母(L ipom yces starkeyi)[4]、对角毛壳菌(Chaetom ium gracile)[5]、曲霉(Aspergillus ustus)[6]、芽胞杆菌(Bacillus)[1]、链球菌(Streptococcus)[7-8]等。据目前报道的右旋糖苷酶中,酶的最适作用温度多在50℃左右[1,3,6-7],对热较敏感,在50℃保温30 min酶活力损55%[6]。海洋中蕴藏着巨大的微生物资源,海洋微生物长期生活在海水环境中,所产生的酶类比那些来自中温物种的酶类在低温条件下具有更高的催化效力。已发现的海洋微生物酶包括有溶菌酶、唾液酸酶、氢化酶、谷氨酰胺酶、葡萄糖脱氢酶、甲基化酶、脂肪酶、DNA聚合酶、木聚糖酶、环糊精酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、氨单价氧化酶等。本课题组已从海洋环境中筛选了10株具有产生右旋糖苷酶的海洋细菌,对其中酶活较高的菌株621进行了形态特征、分子鉴定以及酶性质研究,初步鉴定菌株LP621为交替假单胞菌Pseudoalterom onas tetraodonis。该菌生长温度范围为4～37℃,最适生长温度为25℃;在pH 6.0～11.0范围内生长良好,最适生长pH为10.0;在0.5%～12%的NaCl浓度范围内可以生长,最适生长的NaCl浓度为7%,无NaCl不能生长,是1株低温嗜盐嗜碱菌(另文报道)。该菌产生的右旋糖苷酶作用温度低(30℃),耐热性较好,具有较好的应用前景。目前国内外尚无交替假单胞菌产右旋糖苷酶的报道。本文主要对该菌产低温右旋糖苷酶的培养条件进行优化研究,为低温右旋糖苷酶的进一步研究和开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 1株分离自江苏连云港海域的交替假单胞菌Pseudoalterom onas tetraodonis LP621(在GenBank的登录号为EU84912),由淮海工学院海洋学院实验室分离和保藏。

1.1.2 培养基 种子培养基:蛋白胨0.5%,酵母粉0.1%,陈海水配制,pH 8.0;产酶培养基:酵母膏0.5%,蛋白胨0.5%,乳糖0.5%,右旋糖苷1%,陈海水配制,pH 8.0;陈海水配置人工海水(g/L):VOSO4·2H2O 0.005,LiCl 0.05,H3BO30.1,NiCl2·6H2O 0.01,BaCl2·2H2O 0.005, CuSO4·5H2O 0.01,ZnSO4·7H2O 0.1,CoCl2· 6H2O 0.005,MnCl2·4H2O 0.2,Na2MoO4·2H2O 0.1,KBr 0.05,KI 0.05,NaF 0.05,Al2(SO4)30.05,H2WO40.005,SrCl2·6H2O 0.005。

1.2 方法

1.2.1 产酶发酵方法 接种交替假单胞菌(P. tetraodonisLP621,以下简称LP621)斜面活化后的菌种于种子培养基,摇床振荡培养,25℃、180 r/ min,培养16 h,得种子液。将种子液以2%的接种量接种于产酶培养基(300 mL三角瓶装产酶培养基75 mL),180 r/min,25℃振荡培养24 h。培养结束后取出培养液,以10000 r/min离心5 min,取沉淀。加3 mL缓冲液溶解沉淀,装入10 mL离心管中,冰水浴中超声波破碎5 min。12000 r/min离心10 min,测定上清液的酶活力。

1.2.2 单因素产酶条件的研究 ①培养时间对产酶的影响:将LP621菌株接种到产酶培养基中,培养48 h,其他同1.2.1,每隔4 h取出,测定OD600和酶活力;②温度对产酶影响:分别在不同温度(15、20、25、30℃)下进行产酶发酵实验,其他同1.2.1;③培养基初始pH值对产酶的影响:按照实验标准配方配制1 L基础培养基,配制培养基时需添加缓冲液(醋酸∶硼酸∶磷酸=1∶1∶1),添加浓度为10 mmol/L。加NaOH或HCl分别调pH至5.0～11.0,其他同1.2.1;④NaCl浓度对产酶的影响:用人工海水替代陈海水配置不同NaCl浓度(1%～10%)的产酶培养基,其他同1.2.1;⑤装液量对产酶的影响:摇瓶装液量分别为10%、15%、20%、25%、30%、40%进行产酶试验,其他同1.2.1;⑥碳、氮源对产酶的影响:去除产酶培养基中的乳糖,分别在培养基加入终浓度为0.5%的各种碳源(分别为可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、右旋糖苷、蔗糖、纤维素)进行碳源对产酶影响的发酵试验。去除发酵培养基中的酵母膏和蛋白胨,分别加入终浓度为0.5%的各类氮源(分别为蛋白胨、酵母膏、硫酸氨、胰蛋白胨、酪蛋白、玉米粉)进行氮源对产酶影响的发酵试验,测酶活力。

1.2.3 响应曲面法(RS M)优化发酵条件 在上述各单因素实验的基础上,主要选取了pH、发酵时间、麦芽糖浓度、装液量4个因素作为自变量,以所产的低温右旋糖苷酶的相对酶活为响应值,对海洋交替假单胞菌产右旋糖苷酶的摇瓶培养条件进行优化,利用DX6Trial软件设计实验方案。

1.2.4 酶活力测定 将100μL酶液加入到100 μL 1%的右旋糖苷缓冲液中,在30℃水浴反应15 min,用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖量。酶活力单位定义:在上述反应条件下,每分钟催化产1μg麦芽糖的酶量为1个活力单位。

2 结 果

2.1 单因素培养条件的研究

2.1.1 培养时间对产酶的影响 将LP621菌株接入到培养基中,在25℃下静置培养48 h,每4 h取出测酶活力及LP621菌株生长量(即OD600)。由图1可知,右旋糖苷酶在24 h之前,产酶量上升速度较快,到发酵24 h时(即菌体生长到稳定期)产酶量最高,随时间增加,酶活力逐渐下降。

图1 培养时间对菌株生长和产酶的影响Fig.1 The effect of time on growth of LP621 and production of dextranase

2.1.2 温度对产酶的影响 LP621菌株能在4～37℃下生长,最适生长温度为25℃,属于低温菌(另文报道),因此重点研究了15～30℃温度下对菌株产酶的影响(图2),20～25℃时右旋糖苷酶产量达到最高,低于20℃、高于25℃的情况下产酶均迅速下降。15℃和30℃时分别只有最高产酶量60%和73.1%的产酶量。

图2 温度对右旋糖苷酶产生的影响Fig.2 The effect of temperature on production of dextranase

2.1.3 pH对产酶的影响 LP621菌株生长pH范围为6.0～11.0,最适生长pH为10.0,属于嗜碱菌(另文报道),因此重点研究了pH 5.0～11.0对菌株产酶的影响(图3),随着pH的升高,酶产量逐渐增加,当pH达到6.0时产酶量达到最大; pH继续升高,在pH 7.0～9.0之间酶产量下降较小,趋势平稳,酶活相当稳定;自pH值为9后,酶产量迅速下降。在低于pH 5.0或高于pH 10.0时酶产量均很低。

图3 pH对右旋糖苷酶产生的影响Fig.3 The effect of pH on production of dextranase

2.1.4 不同NaCl浓度对产酶的影响 如图4所示,产右旋糖苷酶的量随NaCl浓度的增加而逐渐增加,当培养基NaCl浓度升至4%时,产右旋糖苷酶最高,进一步升高NaCl浓度则会对LP621菌体生长和右旋糖苷酶酶活积累产生一定的抑制作用。

图4 NaCl浓度对右旋糖苷酶产生的影响Fig.4 The effect of NaCl concentration on production of dextranase

2.1.5 装液量对产酶的影响 通过控制装液量来控制发酵液的溶氧情况,由图5可知,装液量太少溶氧过大,对LP621菌体造成伤害不利于产酶,装液量在25%时产酶适宜。

图5 装液量对右旋糖苷酶产生的影响Fig.5 The Effect of medium amount on production of dextranase

2.1.6 不同碳氮源对产酶的影响 通过在培养基中添加不同的碳源和氮源进行发酵培养,结果见表1。麦芽糖最能促进LP621产酶,乳糖和可溶性淀粉次之,葡萄糖、纤维素不利于产酶,培养基中添加不同碳源对产酶的影响较大。胰蛋白胨促进产酶,酵母膏和酪蛋白、蛋白胨、玉米粉次之,无机氮源不利于产酶。

2.2 响应曲面法(RSM)优化发酵条件

2.2.1 响应面设计实验及其结果 在以上单因素发酵实验的基础上,选取了pH、时间、麦芽糖和装液量4个因素为自变量,以所产的低温右旋糖苷酶的相对酶活为响应值,采用响应面软件设计实验方案,分别发酵测定酶活力,结果见表2。从表2可以看出,在培养基pH为7.0、时间为24 h、麦芽糖浓度为1%、装液量为25%时,测得的酶活最高。但4个因素具体的值还要通过响应面软件进一步分析。

表1 碳氮源对右旋糖酐酶产生的影响Table1 Effect of carbon and nitrogen source on production of dextranase

表2 响应面实验设计及其实验结果Table 2 Experimental design and results response analysis

2.2.2 二次回归拟合以及方差分析 以相对酶活为响应值,经回归拟合后各试验因子对响应值的影响可以用以下函数表示:Y=a0+a1A +a2B+a3C+a4D+a5A2+a6B2+a7C2+ a8D2+a9AB+a10AC+a11AD+a12BC+ a13BD+a14CD。应用响应面软件对26个响应值进行分析所得到的拟合全变量二次回归方程各变量的偏回归系数估计值及方差分析见表3。由表3可知,决定系数R2=0.9013,说明回归方程的拟合程度较好,因此可以用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。由响应面软件可以得出全变量二次回归方程:Y= 79.30+3.95A-0.063B+17.32C+7.00D-7.38A2-4.53B2-6.52C2-3.79D2+3.16AB +4.69AC+0.93AD-1.13BC-1.64BD+ 2.74CD。

表3 回归分析结果Table 3 Results of the regression analysis

2.2.3 发酵条件的最适组合 在获得非线性回归模型和响应面之后,为了求得最佳发酵条件,对所得的回归拟和方程分别对各自的变量求一阶偏导数,求解此方程组可以得到最大酶活时的最佳条件:pH 7.07,发酵时间21.94 h,麦芽糖浓度0.42%,装液量为21.88%,在此条件下理论预测最大相对酶活为99.7%,酶活为270.1 U/mL。

2.2.4 各因素交互作用的响应面图和等高线图

和单因素试验相比响应曲面优化培养条件的优势在于响应面优化法可以考察因素间的交互作用。等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小,椭圆形表示两因素交互作用显著,而圆形则与之相反。根据响应面软件绘出的等高线和响应面立体分析图(图6～图11),可以得出培养基pH、麦芽糖浓度和装液量对产酶的影响较大,之间的交互作用都很显著,这与方差分析中显著性的分析结果相符。

图6 发酵时间和pH对产右旋糖苷酶影响的响应面立体分析图和等高线Fig.6 Response surface plot and contour plot of dextranase production showing interaction between time value and pH value at the central value of the other parameter

图11 麦芽糖浓度和和装液量对产右旋糖苷酶影响的响应面立体分析图和等高线Fig.11 Response surface plot and contour plot of dextranase production showing interaction between he concentration ofmaltose and liquid filling quantity at the central value of the other parameter

2.2.5 验证实验 在优化后的培养基及培养条件下进行5组平行试验,所得酶活分别为270.1、270.1、270.1、270.1、270.1 U/mL,平均值为270.1 U/mL。回归方程所得到的纳他霉素产量的预测值(2.19 g/L)与验证试验的平均值(2.14 g/L)相接近,说明回归方程能够较真实地反映各筛选因素对发酵产酶的影响。

3 讨 论

交替假单胞菌属(Pseudoalterom onas)是Gauthier G等[9]在1995年提出的一个新建立的海洋细菌属。目前在世界范围海洋中,包括南极洲严寒海洋环境中分离到多株交替假单胞菌,已经鉴定到种的有P.tunicata、P.agarolytic和P.bacteriolytica等30多种,每年都有新种发现[10-13]。其独特的生物学特性引起了越来越多研究者的关注,该属菌能够产生多种活性物质,表现出多种生物活性。交替假单胞菌能分泌多种胞外活性物质,包括胞外酶、胞外毒素、抗生素和胞外多糖等,这些物质表现出抗菌、溶菌、杀菌、分解半乳糖、降解纤维素和果胶以及软化琼胶等多种生物活性,有助于交替假单胞菌获取营养和竞争生存空间等,具有很重要的生态学作用[14]。目前交替假单胞菌产生的低温酶主要有脂肪酶、琼脂糖酶、α-半乳糖酶、DNA连接酶、蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶等[15-20]。

菌株LP621为交替假单胞菌,是本课题组从海洋环境中筛选的1株交替假单胞菌属(Pseudoalterom onas),并从培养液中检测到了右旋糖苷酶的活性,但活性不高,为了获得大量的酶,以便于酶性质的研究和酶基因的克隆表达,采用单因素和响应面方法对菌株产酶条件进行了优化研究。目前国内外没有交替假单胞菌属产右旋糖苷酶的研究报道。

菌株LP621是需氧的革兰阴性杆菌,最适生长温度为25℃,生长温度范围为4～37℃;最适生长pH为10.0,在pH 6.0～11.0范围内生长良好;最适生长的NaCl浓度为7%,在0.5%～12%的NaCl浓度范围内可以生长,无NaCl不能生长,是1株低温嗜盐嗜碱菌。该菌株生长4 h即进入对数期,培养24 h菌株为平衡期时,菌株产酶到达高峰。菌株低于20℃时生长缓慢,此时产酶量也相应降低;而25℃时,菌体生长最快,此时也是产酶的最佳温度,这与文献[21]中报告的产酶最佳温度与菌株生长温度一致。LP621菌株生长和产酶的pH和NaCl浓度范围与文献中报告基本一致,但最适生长和产酶的pH和NaCl浓度不一致。最适生长pH为10.0,最适产酶pH为6.0,而到pH为10.0酶活下降;最适生长的NaCl浓度为7%,但NaCl浓度为4%时产酶较高。

[1]Khalikova E,Susi P,Usanov N,et al.Purification and properties of extracellular dextranase from a Bacillus sp.[J].J.Chromatogr B,2003,796(2):315-326.

[2]Khalikova E,Susi P,Korpela T.Microbial dextran-hydrolyzing enzymes:fundamentals and applications[J].Microbiol Mol Biol Rev,2005,69(2):306-325.

[3]Aslan Y,Tanriseven A.Immobilization of Penicillium lilacinum dextranase to produce isomaltooligo saccharides from dextran [J].Biochem Eng,J,2007,34(1):8-12.

[4]Chen L,Zhou X,Fan W,Zhang Y,et al.Expression,purification and characterization of a recombinant Lipomyces starkey dextranase in Pichia pastoris[J].Protein Expr Purif,2008,58 (1):87-93.

[5]Hattori A,Ishibashi K,Minato S.The purification and characterization of the dextranse of Chaetom ium gracile[J].Agri Bio Chem,1981,45(11):2409-2416.

[6]程秀兰,孙晋武,王海燕,等.焦曲霉右旋糖苷酶的纯化和性质[J].微生物学报,1992,32(3):218-226.

[7]蒋丹,仇元新,胡涛,等.口腔链球菌右旋糖苷酶分子结构和功能的研究进展[J].国际口腔医学杂志,2008,35(3):249-251.

[8]Kim YM,Seo M Y,Kang H K,et al.Construction of a fusion enzyme of dextransucrase and dextranase:Application for one step synthesis of isomalto-oligosaccharides[J].Enzy Micro Tech,2009,44(3):159-164.

[9]Gauthier G,Gauthier M,Christen R.Phylogenetic analysis of the genera Alteromonas,Shewanella,and Morltella using genes coding for small-subunit rRNA sequences and division of the genus Alteromonas into two genera,Alteromonas(emended)and Pseudoalteromonas gen.nov,and proposal of twele new species combinations[J].Int J Syst Bacteriol,1995,45:755-761.

[10]Carolina CR,Rowley AF.Effect of extracellular products of Pseudoalterom onas atlantica on the edible crab Cancer pagurus [J].Appl Environ Microbiol,2004,70(2):729-735.

[11]Park YD,Baik KS,Yi H,et al.Pseudoalterom anas byunsanensis sp.nov.,isolated from tidal flat sediment in Korea[J].Int J Syst Evol Microbiol,2005,55:2519-2523.

[12]Al Khudary R,Stösser N I,Qoura F,et al.Pseudoalterom onas arcticasp.nov.,an aerobic,psychrotolerant,marine bacterium isolated from Spitzbergen[J].Int J Syst Evol Microbilo,2008, 58(9):2018-2024.

[13]Yu Y,Li H,Zeng Y,et al.Extracellular enzymes of cold-adapted bacteria from Arctic sea ice,Canada Basin[J].Polar Biology, 2009,32(10):1539-1547.

[14]席宇,朱大恒,刘红涛,等.假交替单胞菌及其胞外生物活性物质研究进展[J].微生物学通报,2005,32(3):108-112.

[15]Vera J,Aluarez R,Murano E,et al.Identification of a Marine Agarolytic Pseudoalterom onas Isolate and Characterization of Its Extracellular Agarase[J].Appl Emirom Microbiol,1998,64 (11):4378-4383.

[16]Bakunina IY,Sova VV,Nedashkovskaya O I,et al.Alpha-galactosidase of the marine bacterium Pseudoalterom onas sp. K MM701[J].Biochemisty(Masc),1998,63(10):1209-1215.

[17]Ceorlette D,Jonsson ZO,Van Petegem F,et al.A DNA ligase from the psychrophile Pesudoalterom onas haloplankitis gives insights into the adaptation of proteins to low temperatures[J]. Eur J Biochem,2000,267(12):3502-3512.

[18]李丹,陈丽,李富超,等.一株海洋细菌Pseudoalteromonas flavipulchraHH407产低温碱性蛋白酶的筛选与生长特性的研究[J].食品与生物技术学报,2007,26(6):74-80.

[19]吕明生,吕凤霞,房耀维,等.低温纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质初步研究[J].食品科学,2007,28(12): 235-239.

[20]刘红飞,吕明生,王淑军,等.产低温淀粉酶海洋细菌Pseudoalteromonas sp.GS230发酵条件与酶学性质的研究[J].中国酿造,2008,13:13-18.

[21]程秀兰,孙晋武,杨敬,等.淡紫拟青霉右旋糖苷酶的形成条件[J].微生物学报,1992,32(5):334-339.

Culture Optimization of Dextranase-Producing Pseudoalterom onas tetraodonis LP621

LV Ming-sheng1,2,WANG Shu-jun1,2,FANG Yao-wei1,2, JIAO Yu-liang1,2,LIU Shu1,2,ZHANGLu1,WU Bin-bin1
(1.Coll.of Marine Sci.and Technol.,Huaihai Inst.of Technol., Lianyungang,222005; 2.Jiangsu Marine Res.Devel.Res.Inst.,Lianyungang, 222001,China)

A dextranse-producing marine bacteria Pseudoalterom onas tetraodonisLP621 was screened and isolated from the sea area of Lianyungang,Jiangsu.Its dextranase production conditions was optimized through single-factor and orthogonal experiments.The results of single factor experiment indicated that the most suitable culture condition was 24 hours,and the most suitable dextranse producing temperature was 25℃at pH 6.0 with ranging 5.0～11.0, and the range of the concentration of NaCl for the dextranse production was 1%～10%,and the yield of dextranase was fairly high at 4%of NaCl with filling volume rate at 25%.Maltose,tryptone,and yeast extract enhanced the enzyme production.Response surface method was adopted to optimize the enzyme production fermentation conditions. Medium pH,time,maltose,and filling volume four factors were selected for the optimization.And the results were pH 7.07,21.94 h,maltose 0.42%,and filling volume 21.88%,the enzyme activity was 270.1 U/mL.

dextranase;Pseudoalterom onas tetradonis;optimization

Q939;TS275.4

A

1005-7021(2010)06-0011-07

国家自然科学基金(40746030);江苏省科技厅工业支撑计划项目(BE2009095);江苏省海洋生物技术重点建设实验室开放课题项目(2008HS008);连云港市自然科学基金(ZH200801)

吕明生 男,副教授。研究方向为海洋生物技术。Tel:0518-85895421,E-mail:mingshenglu@hotmail.com

＊通讯作者。E-mail:shujunwang86@163.com

2010-11-01;

2010-11-21