普鲁兰多糖高产菌株Y68葡萄糖基转移酶的纯化及特性研究

段效辉,耿金培,方绍庆,李俊峰

(1.烟台出入境检验检疫局,山东烟台 264000;2.青岛科技大学,山东青岛 266003)

普鲁兰多糖高产菌株Y68葡萄糖基转移酶的纯化及特性研究

段效辉1,耿金培1,方绍庆1,李俊峰2

(1.烟台出入境检验检疫局,山东烟台 264000;2.青岛科技大学,山东青岛 266003)

运用离子交换层析法和凝胶过滤层析法分离纯化普鲁兰多糖高产菌株Y68胞内葡萄糖基转移酶(简称GTF),并以SDS-PAGE、Native-PAGE对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定,研究其酶学特性。结果表明短梗霉Y68中GTF被分离纯化,纯化酶在SDS-PAGE凝胶电泳上显示分子量50.8 ku单一条带,而在Native-PAGE凝胶电泳上显示分子量350 ku单一条带。纯化酶的最适酶反应pH和最适酶反应温度分别为6.0和40℃,酶对pH十分敏感,稳定性较差,对温度的稳定性则稍好。GTF为金属酶,Na+和K+对酶有激活作用,Ca2+、Mn2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+、Fe2+、Hg2+、Co2+对酶活性有抑制作用,Hg2+对酶活性的抑制作用说明酶活性中心含有二锍键。EDTA、PMSF、SDS和碘乙酸对GTF活性有很大的抑制作用,而二硫苏糖醇(DTT)对酶活性有保护作用。

短梗霉;葡萄糖基转移酶;胞内酶;纯化

普鲁兰多糖是一种由出芽短梗霉发酵所产生的类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质多糖。该多糖有两个重要的特性:结构上富有弹性,溶解度比较大。普鲁兰多糖的成膜性、阻气性、可塑性、粘性均较强,并且具有易溶于水、无毒无害、无色无味等优良特性,像很多的微生物胞外多糖一样已广泛应用于医药、食品、轻工、化工和石油等领域[1-2]。2006年5月19日,国家卫生部发布了第8号公告,普鲁兰多糖为新增4种食品添加剂之一,可在糖果、巧克力包衣、膜片、复合调味剂和果蔬汁饮料中用作被膜剂和增稠剂。普鲁兰多糖在食品领域越来越广泛的应用也使得对该多糖的工业化生产变得迫在眉睫。葡萄糖基转移酶(GTF)是糖基转移酶的一种,它具有催化高能底物合成聚糖的功能,来自于微生物的GTF能够从许多形式的D-葡萄糖基供体物质中把非还原的D-葡萄糖残基转移到合适的受体物质,它也能够帮助转移葡萄糖基到C6羟基从而合成寡糖和糖苷,并进而组装成为线性或分枝的糖链[3]。目前研究较多的有引起龋齿的变形链球菌中的GTF及微生物合成海藻糖必需的GTF等。微生物出芽短梗霉可合成胞外普鲁兰多糖,作为一种具有转葡糖苷作用的转移酶,GTF在普鲁兰多糖的合成中扮演着怎样的角色,目前还未见报道。本实验室保存的短梗霉菌株Y68,不产黑色素,转化率高,胞外普鲁兰多糖产量最高可达14.7 g/g细胞干重[4-5],明显高于目前报道的其他短梗霉菌株的产量,具备了研究高产菌株普鲁兰多糖产量与GTF间关系的基础。本研究对普鲁兰多糖高产菌株Y68细胞内GTF活力与胞外多糖产量间的关系进行研究,并分离纯化其细胞内GTF,研究其酶学特性,为实现普鲁兰多糖工业化生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 普鲁兰多糖高产菌株短梗霉Y68 (本实验室于-80℃保藏)。

1.1.2 培养基 ①YPD培养基:可溶性淀粉20.0 g,蛋白陈20.0 g,酵母粉10.0 g,葡萄糖20.0 g,蒸馏水1000 mL,115℃,灭菌30 min;②豆饼粉水解液培养基(质量体积比,%):葡萄糖2.0,豆饼粉水解液2.0,K2HPO40.5,NaCl 0.1,MgSO4·7H2O 0.02,(NH4)2SO40.06,初始pH 6.5,121℃,灭菌20 min。

1.1.3 仪器 超滤系统:LabscaleTMTFF System, Millipore,美国;蛋白质纯化系统:ÄKTATMpri me with HitrapTM,Amersham,瑞典;双向电泳系统: Amersham,瑞典。

1.2 方法

1.2.1 Y68细胞外普鲁兰多糖产量与细胞内GTF活力的关系研究 分别选择葡萄糖、蔗糖、糊精、果糖、麦芽糖和木糖作为培养基唯一碳源,28℃培养60 h后,测定不同碳源情况下胞外普鲁兰多糖产量和胞内GTF活力。①胞外普鲁兰多糖产量的测定:Y68菌株28℃发酵培养60 h,发酵液沸水浴15min,降温后离心(12000 r/min,4℃, 6 min)。取上清液3 mL,加入2倍体积的冰冻无水乙醇,混合均匀,将混合物于4℃下放置数小时,离心(12000 r/min,4℃,6 min)。弃上清液,将获得的多糖在80℃烘干至恒重,电子天平称重;②GTF活性测定:在10 mm×150 mm试管加入0.2 mL,10 mmol 4-硝基-α-D-吡啶葡萄糖苷(PNPG),在40℃水浴中进行温度平衡5 min(4-硝基-α-D-吡啶葡萄糖苷用0.1 mol/L,pH 4.0乙酸钠缓冲液进行配制);在温度平衡的底物试管中加入0.2 mL经过适当稀释的待测酶液,快速混匀后开始计时,反应时间共5 min;反应达到预定时间时,加入3 mL 0.4 mol/L、pH 10.5的甘氨酸-NaOH缓冲液中止反应;测定OD405nm,由标准曲线进行计算。酶活单位定义为每分钟释放1μmol 4-硝基酚所需要的酶量[6]。

1.2.2 GTF蛋白的纯化 结合Sephadex G-200凝胶过滤和DEAE-Sephorose Fast Flow阴离子交换2种色谱方法,纯化Y68细胞内GTF,收集具有GTF酶活力的洗脱液进行酶学特性分析,并利用蛋白电泳进行量化分析。①总蛋白的测定:蛋白含量测定采用Bradford的方法,以牛血清白蛋白为标准[7];②粗酶液的制备:活化菌种接种于装有50 mL豆饼粉水解液培养基的三角瓶中28℃、180 r/min培养8～10 h,4℃、2500 r/min离心5 min收集菌体,冷冻蒸馏水洗涤3次,每50 mL培养液得到的菌体用磷酸盐缓冲液重新悬浮后加入0.1 mL、10 mg/mL消解酶(zymolyase,Sigma),37℃,酶作用90 min。4℃、14000 r/min离心20 min,去除细胞碎片,上清即为粗酶液。多次处理得到的粗酶液,在超滤系统浓缩至6～9 mL。整个超滤过程在4℃下进行;③Sephadex G-200凝胶过滤:将超滤后得到的浓缩液上样至上述平衡后且均匀的凝胶柱。在柱压0.1 MPa、流速0.5 mL/min条件下洗脱,自动分部收集,每管收集3 mL,测定每个收集管GTF活力和总蛋白含量。整个洗脱过程在Amersham蛋白质纯化系统中4℃下进行,波长280 nm下检测样品光吸收,自动分部收集,每管收集3 mL;④DEAE-Sephorose Fast Flow阴离子交换:将凝胶过滤分部收集的具有GTF活力的收集管合并,使用50 ku离心超滤膜(Millipore,美国),4℃、14000 r/min离心浓缩至4～6 mL,除0.5 mL用于凝胶电泳检测外,全部上样至16 cm×25 cm DEAE-Sephorose Fast Flow阴离子交换层析柱,在柱压0.3MPa、流速1 mL/min下用1 mol/L NaCl和离子交换缓冲液梯度洗脱,利用Amersham蛋白质纯化系统自动分部收集,每管收集3 mL;⑤超滤浓缩收集液:经离子交换层析收集的样品使用50 ku离心超滤膜(Millipore,美国),4℃、14000 r/min离心浓缩至4～6 mL;⑥不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE):参照Laemmli的方法进行SDS-PAGE凝胶电泳[8];⑦连续常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(N-ative-PAGE):参照Laemmli的方法进行SDSPAGE凝胶电泳[8];⑧GTF活力的测定:同

1.2.1 ②。

1.2.3 Y68细胞内GTF酶学特性研究 ①酶的最适反应温度和温度稳定性:酶反应混合物分别于28、30、37、40、42、45、50、55、60和65℃水浴中反应5 min,分别测定GTF活力,确定酶的最适反应温度。将纯化的酶液置于28、30、37、40、42、45、50、55、60和65℃水浴中保温10 min,按常规酶活测定方法测剩余酶活力,确定酶的温度稳定性;②酶的最适反应pH和pH稳定性:分别以pH为3.0、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、7.0、8.0的缓冲液取代原测定方法中的缓冲液,测定不同pH下GTF的活力,确定酶的最适反应pH。使用的缓冲液包括0.01 mol/L乙酸缓冲液(pH 4.0～5.0), 0.01 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0～7.0)和0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5～9.0)。纯化的酶液分别与pH为3.0、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、7.0、8.0的缓冲液等体积混合,4℃保温30 min,按常规酶活测定方法测剩余酶活力,确定酶的pH稳定性;③金属离子对酶活性的影响:在酶活测定反应混合物中加入Ba2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、K+、Na+、Hg+,一价离子使用浓度为12.5 mmol/L,二价离子使用浓度为25 mmol/L,测定GTF活力;④各种蛋白抑制剂对酶活性的影响:将各种蛋白抑制剂(二硫苏糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、碘乙酸、十二烷基硫酸钠(SDS))加入纯化的酶液中,4℃保温10 min,按常规酶活测定方法测剩余酶活力;⑤Km和Vm ax值的测定:为测定纯化酶液对PNPG的Km和Vm ax,测定PNPG的浓度分别为0.5、2.5、5.0、7.5和10 mmol/L时的GTF活力;以底物浓度的倒数为横坐标,反应速度倒数为纵坐标做图。

2 结 果

2.1 不同碳源情况下胞外普鲁兰多糖产量与胞内GTF活力的关系

以不同的碳源配制的培养基28℃、180 r/ min培养Y68菌株60 h,测定其胞内GTF的活力和胞外普鲁兰多糖产量,研究碳源对GTF活力的影响,了解GTF与胞外多糖产量之间的关系,结果见图1。

图1 不同碳源培养基对胞外普鲁兰多糖产量和胞内GTF的影响Fig.1 The changes in pullulan yield and enzyme activity in the fermentation medium with different carbon sources

由图1看到,当葡萄糖作为培养基中唯一碳源时,GTF的活力相对于其他碳源培养基是最高的,而木糖作为唯一碳源时活力是最低的,其变化规律与胞外多糖产量的变化基本相同。这一结果表明该酶与胞外多糖产量之间关系密切,很可能碳源通过对GTF的影响进而影响到胞外多糖产量的变化。从另一方面也可以说明胞内GTF有效促进了胞外普鲁兰多糖的产生。

2.2 GTF的分离与纯化

2.2.1 GTF的分离纯化 将3.0 mL经超滤浓缩的粗酶液上样至经凝胶过滤缓冲液平衡的Sephadex G-200凝胶过滤层析柱上,用凝胶过滤缓冲液洗脱。经酶活测定得知,粗酶液在Sephadex G-200凝胶过滤中出现第1个洗脱峰具有GTF活性。将Sephadex G-200凝胶过滤自动收集的、具有GTF活力的收集管合并,全部上样至经阴离子交换缓冲液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱,待样品被凝胶吸收后,阴离子交换缓冲液洗涤层析柱1 h,用1 mol/L NaCl和离子交换缓冲液进行梯度洗脱,经酶活测定发现,在NaCl浓度达到0.59 mol/L时,出现的第1个峰具有GTF活力。将具有活性的纯化酶液用50 ku的离心超滤膜(Millipore,美国)浓缩至4～6 mL,电泳检测纯度并进行分子量测定,结果见表1。

表1 GTF的分离纯化结果Table 1 Summary of purification procedures of glucosyltransferase

普鲁兰多糖高产菌株Y68经细胞破碎释放胞内蛋白、超滤浓缩、Sephadex G-200凝胶过滤和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析等纯化过程,经SDS-PAGE和Native-PAGE电泳证实, GTF被纯化,纯化倍数2.49倍,收率13.9%。

2.2.2 不连续SDS-PAGE和连续Native-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 经浓缩的纯化酶液20μL与等量的SDS-PAGE电泳样品缓冲液混合,沸水加热5 min,上样至5%浓缩胶、12%分离胶制成的非连续聚丙烯酰胺凝胶上、120 V稳压电泳至溴酚蓝前沿进入分离胶,改用200 V稳压电泳至溴酚蓝前沿离凝胶下沿1～2 cm。结束电泳小心取出凝胶,按上述方法用考马斯亮蓝进行染色,结果见图2。图2显示目标蛋白为单一条带,经凝胶成像系统(G:Box Syngene,英国)分析,纯化蛋白的表观分子量为50.8 ku。

图2 纯化蛋白在SDS-PAGE电泳图Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified glucosyltransferase 1:粗酶液;2:凝胶过滤层析;3:离子交换层析;4:蛋白Marker

取经浓缩的纯化酶液20μL与等量的Native-PAGE电泳样品缓冲液混合,上样至5%浓缩胶、10%的连续聚丙烯酰胺凝胶上,120 V稳压电泳至溴酚蓝前沿进入分离胶,改用200 V稳压电泳至溴酚兰前沿离凝胶下沿1～2 cm。结束电泳小心取出凝胶,按上述方法用考马斯亮蓝进行染色,结果见图3。由图3可看出,纯化蛋白仍为单一条带,但是经凝胶成像系统分析,纯化蛋白的表观分子量变为350 ku。

图3 纯化蛋白在Native-PAGE电泳图Fig.3 Native-PAGE analysis of the purified glucosyltransferase 1:凝胶过滤层析;2:离子交换层析;3:蛋白Marker

实验结果表明,短梗霉Y68的GTF在SDS-PAGE和Native-PAGE上都呈现单一条带,Native-PAGE上的分子量大于McCleary和Gibson[9]报道的黑曲霉中的GTF分子量(116 ku)。在两凝胶中呈现的分子量差别较大,其原因可能是该GTF由几个分子量相似的亚基组成,从而与黑曲霉中的GTF作用方式也会有很大不同,很可能是几个复合亚基的共同作用。

2.3 GTF的酶学特性

2.3.1 酶的最适反应温度和温度稳定性 反应混合物分别于28、30、37、40、50、55、60和65℃水浴中反应5 min,分别测定GTF活力,结果见图4。由图4可以看出,纯化酶液在反应温度低于40℃的范围内,酶活随温度的升高而升高,在反应温度为40℃时达到最高,当反应温度大于40℃时,随着温度的升高酶活迅速下降。值得注意的是,作为胞内酶,该酶在低于40℃的条件下相对稳定,能保持较高活力。

图4 温度对GTF活力(A)及热稳定性(B)的影响Fig.4 Effect of temperature on activity(A)and thermal stability(B)of glucosyltransferase from Y68

温度对酶的活力影响主要体现在2个方面:一方面温度升高,与一般化学反应一样,反应速度加快;另一方面随着温度的升高,酶蛋白逐渐变性,反应速率随之下降。酶的最适反应温度是这2个方面平衡的结果。最适反应温度往往受到反应时间、底物浓度、酶浓度、pH值、激活剂或抑制剂等因素的影响。在本实验条件下,纯化的GTF反应的最适温度为40℃。该酶热稳定性差于McCleary和Gibson[9]报道的黑曲霉中的GTF,其最适温度也远低于黑曲霉中的GTF(70℃)。

2.3.2 GTF的最适作用pH 分别以pH为4.0、5.0、6.0、6.6、7.0、7.6、8.0、9.0的缓冲液,取代酶活测定中反应混合物中的缓冲液,测定不同pH下GTF的活力,结果见图5A。纯化的酶液分别与pH为3.0、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、7.0、8.0的缓冲液等体积混合,4℃保持30 min,测定剩余酶活力,结果见图5B。

图5 pH对GTF活力(A)及稳定性(B)的影响Fig.5 Effects of pH on activity(A)and stability(B)of glucosyltranslase

从图5A可看出,GTF酶在pH 3.0～6.0之间随着pH的上升酶活提高,在pH 6.0时酶活最高,当pH大于6.0时,酶活迅速下降,说明该酶对pH的变化也非常敏感。pH变化对酶活的影响主要是由于酸碱改变酶的空间结构使酶失活,或酸碱影响酶的活性部位使可解离基团解离、酶分子活性中心催化基团和结合基团的解离、底物的解离以及酶-底物复合物的解离,从而影响反应动力学性质,影响酶反应速度。最适反应pH也不是酶的特征性物理常数,它往往受到反应时间、底物、酶浓度、反应温度、激活剂或抑制剂等因素的影响,因此酶的最适反应pH只是一定反应条件下的结果。图5B表明,在本实验条件下,纯化的GTF反应的最适pH为6.0,在低于pH 4.6或高于pH 6.0的环境中保持30 min,酶活均迅速下降,说明类酵母GTF的pH稳定性相对较差。这一特性与McCleary和Gibson[16]报道的该酶的最适pH(4.0～4.5)不同而pH稳定性则几乎相同。

2.3.3 金属离子对GTF活性的影响 将酶活性测定反应混合物中加入Cu2+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Ba2+、K+、Na+、Hg+,一价离子的浓度为12.5 mmol/L,二价离子的浓度为25 mmol/L,测定GTF活力,结果见图6。

图6 金属离子对GTF活力的影响Fig.6 Effects of different ions on activity of glucosyltransferase in Aureobasidium pullulans Y68

实验中测定了10种金属离子对纯化的GTF活性的影响。结果发现K+和Na+对酶活性有激活作用,酶活力分别提高了15.4%和29.1%。而Hg2+、Co2+、Mn2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+和Fe2+对酶活有抑制作用,酶活力分别被抑制82.8%、19.8%、11.1%、64.7%、15.3%、14%、8.9%和17.9%。酶活性被Hg2+离子抑制表明酶活性中心二硫键被破坏。

2.3.4 不同蛋白质抑制剂对酶活力的影响 将各种蛋白质抑制剂加入纯化的酶液中,4℃保持10 min,测定剩余酶活,结果见表2。表2显示, EDTA、PMSF、碘乙酸和SDS对酶活均有很大的抑制作用,而DTT对酶活性有保护作用。EDTA抑制酶活性说明GTF是金属酶。PMSF和碘乙酸对酶活有抑制作用,说明该酶的活性中心存在丝氨酸(Ser)残基和半胱氨酸(Cys)残基。

2.3.5 酶的动力学常数 以Lineweaver-Burk双倒数作图法测定米氏常数Km。GTF对PNPG的Km如图7所示,Km和Vm ax分别为1.03 mmol/ mL和1.107μg/min。

表2 不同蛋白质抑制剂对GTF活力的影响Table 2 Effects of different compounds on glucosyltransferase activity

3 讨 论

本研究表明,短梗霉菌株Y68合成的胞外多糖产量与胞内GTF活力成正比例关系。与口腔内变形链球菌合成胞外多糖形成龋齿相似[10], GTF活力高的情况下,其胞外多糖产量也高;同样GTF活力低的情况下,胞外多糖产量也低。葡萄糖是产生高活力GTF和高产量胞外多糖的最佳碳源。适宜的碳源促进了GTF活力,高的GTF活力是较高胞外普鲁兰多糖产量的必要前提。本研究还纯化了高产普鲁兰多糖菌株Y68胞内GTF,结果表明:在酶学特性上,与已有相关报道相比,本研究中短梗霉Y68胞内GTF与之前报道的黑曲霉中的相应酶从分子量和酶学特征方面都有很大差异。如其分子量为350 ku,明显高于黑曲霉中116 ku的分子量。另外,Y68细胞中该酶只在40℃以下、pH 4.6～6.0条件下保持较好稳定性,明显差于黑曲霉GTF在65℃、pH 4.0～7.0还保持较高活力的稳定性。同样,金属离子对2种生物内的GTF活力也有不同的影响,Mn2+对Y68细胞中GTF活力有微弱抑制作用而对黑曲霉中GTF活力则有显著的促进作用。多方面物理生化特征的差异导致了不同生物细胞内GTF作用方式的不同。可以推测,正是这种作用方式的不同才使得不同微生物合成了多种结构不同的胞外多糖。本实验室还会继续对短梗酶菌株Y68细胞内其他与胞外多糖合成相关的酶,如磷酸葡萄糖变位酶、尿嘧啶二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶等进行研究。一方面通过分离纯化得到各相关酶,并模拟胞外多糖合成条件,进行体外胞外多糖合成的试验,了解胞外普鲁兰多糖合成的机理;另一方面希望通过对各相关酶基因的克隆与表达,从基因水平上调节其胞外多糖的合成,从而可以从分子水平探究其胞外多糖合成机理并建立起GTF高表达株,最终实现胞外多糖的工业化生产。

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Purification and Features of Glucosyltransferase from Pullulan High-Yielding Stra in Y68

DUAN Xiao-hui1,GENG Jin-pei1,FANG Shao-qing1,L IJun-feng2
(1.Yantai Entry-Exit Inspect.&Quar.Bureau.,Yantai264000;2.Qingdao Uni.of Sci.&Technol.,Qingdao266003)

Intracellular glucosyltransferase(GTF)from pullulan high-yielding strain Y68 was isolated and purified by ion exchange chromatography and gel filtration chromatography,the protein was qualified,compared and characterized to study its enzymological features by SDS-PAGE and Native-PAGE.The results showed that GTF from Aureobasidium pullulans was isolated and purified and its molecular mass 350 ku with single band on the Native-PAGE gel,but 50.8 ku with single band on the SDS-PAGE gel which indicated the enzyme was composed of several subunits.The most suitable reaction pH and temperature of purified GTF was 6.0 and 40℃respectively,and the enzyme was very sensitive to temperature and had poor stability.GTF was an metallic enzyme,Na+and K+could activate it.However, Ca2+,Mn2+,Mg2+,Ba2+,Cu2+,Fe2+,Hg2+,and Co2+inhibited its activity.The inhibition of Hg2+against it indicated that the activity core of the enzyme contained bi-sulphonium bond.EDTA,PMSF,SDS,and iodo-acetidin greatly inhibited GTF’s activity;but dithiothreitol(DTT)had protective role of its activity.

Aureobasidium pullulans;glucosyltransferase;purification

Q55

A

1005-7021(2010)06-0032-07

国家质检总局科研项目(20051K022)

段效辉 女,工程师,博士。主要从事食品微生物检测和研究工作。

Tel:0535-6665905,E-mail:xiaohuiduan66@yahoo.com.cn

2010-07-28;

2010-10-29