抗噬菌体重组钝齿棒杆菌的生理稳定性

胡永飞,李铁民,张 博,杨志勇,李 玉

(辽宁大学生命科学院,辽宁沈阳 110036)

抗噬菌体重组钝齿棒杆菌的生理稳定性

胡永飞,李铁民＊,张 博,杨志勇,李 玉

(辽宁大学生命科学院,辽宁沈阳 110036)

为了探索抗噬菌体重组钝齿棒杆菌的应用可行性,对重组质粒pJL23-cglⅠ在钝齿棒杆菌中的稳定性以及其对宿主细胞生长代谢的影响进行了研究。实验结果表明,重组质粒在钝齿棒杆菌中具有较好的稳定性,它在钝齿棒杆菌中的存在对重组菌株的早期生长有些影响,但未影响重组菌株的谷氨酸产生量。

钝齿棒杆菌;重组质粒;质粒稳定性;生长速率;谷氨酸

钝齿棒杆菌是产生谷氨酸的菌株之一,其不同衍生株在生产中得到了广泛应用。然而,由于发酵生产的规模化和连续性,生产中的菌种极易感染噬菌体,所以噬菌体污染一直是影响谷氨酸发酵生产的关键因素之一。虽然通过改进生产工艺,改善卫生条件,控制生产环节,噬菌体污染现象有所减轻,但仍时常发生[1-2]。为了解决谷氨酸发酵中的噬菌体污染问题,利用质粒携带的cglⅠ基因复合体构建了抗噬菌体钝齿棒杆菌基因工程菌,证实了cglⅠ基因复合体在钝齿棒杆菌中的抗噬菌体功能活性[3]。由于构建抗噬菌体基因工程菌的策略采用的是质粒表达外源基因,而且表达的外源基因是限制修饰(RM)系统基因复合体,所以重组质粒以及其所携带的RM在钝齿棒杆菌中的行为如何尚需实验证实。为此,本文对重组质粒在钝齿棒杆菌中的稳定性以及其对宿主细胞生长代谢的影响进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 钝齿棒杆菌T6-13(野生型)购自中国典型培养物保藏中心,含有质粒pJL23-cglⅠ的重组钝齿棒杆菌由本实验室构建[3]。

1.1.2 噬菌体 5株噬菌体AS-I V3C44～ASI V3C48购自武汉病毒研究所。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养 钝齿棒杆菌T6-13(野生型)和重组钝齿棒杆菌培养于LB培养基(固体或液体),需要时添加50μL/mL卡那霉素。

1.2.2 噬菌体裂解液的制备 具体方法参见文献[4]。

1.2.3 噬菌体效价测定 具体方法参见文献[4]。噬菌体效价(pfu/mL)=噬菌斑数×稀释倍数×10。

1.2.4 噬菌体抗性检测 采用平板空斑法,成斑率(Efficiency of plaquing,EOP)计算方法见下式[5],敏感菌株的EOP等于1。

1.2.5 菌株传代[6]在LB/Km-平板上划线接种重组钝齿棒杆菌,30℃培养24 h后挑取单菌落,连续划线接种传代100次。将传代次数为1、10、20、30、……80、90、100的平板4℃保存。

1.2.6 质粒分离稳定性测定[6]从不同传代次数(1、10、20、30、……80、90、100)的LB/Km-平板上,用无菌牙签分别挑取100个单菌落,分别在LB/Km-和LB/Km+平板对应位置上划短线,30℃过夜培养。计数不同代次重组菌株在LB/Km-和LB/Km+平板上的生长数,计算重组菌株在无Km选择压力条件下质粒的丢失率。质粒稳定性(%)=(LB/Km+平板上的生长数)/(LB/Km-平板上的生长数)×100%。

1.2.7 质粒结构稳定性测定[6]从不同传代次数(原代、20、40、60、80、100)的LB/Km-平板上,用无菌牙签分别挑取菌落接种于LB液体培养基中,30℃过夜培养后,采用噬菌体抗性实验检测重组菌株质粒的结构稳定性。

1.2.8 生长曲线测定[7]以野生菌株作对照,测定重组菌株的生长曲线,实验重复3次,实验数据为3次实验的平均值。

1.2.9 谷氨酸测定[7]重组菌株与野生菌株(对照)分别摇瓶发酵培养48 h,从20 h起开始取样,每隔4 h取样1次,取样时间分别设为20、24、28、32、36、40、44、48 h。采用大肠埃希菌L-谷氨酸脱羧酶解法使谷氨酸分解成CO2气体,用微量呼吸检压仪定量测定产生的CO2量,根据反应方程式计算出谷氨酸含量。实验重复3次,实验数据为3次实验的平均值。

2 结 果

2.1 重组质粒pJL23-cglⅠ在钝齿棒杆菌中的分离稳定性

重组钝齿棒杆菌在无卡那霉素抗性选择压力的条件下,在LB固体平板上连续传代100次,每隔10代次检测1次质粒丢失情况。实验结果表明,重组质粒pJL23-cglⅠ在重组钝齿棒杆菌中未见明显丢失现象(见表1)。

表1 重组质粒pJL23-cglⅠ在钝齿棒杆菌中的分离稳定性Table 1 Segregation stability of recombinant plas mid pJL23-cglⅠinC.crenatum

2.2 重组质粒pJL23-cglⅠ在钝齿棒杆菌中的结构稳定性

表2 重组钝齿棒杆菌在不同传代次数中的噬菌体抗性(EOP)Table 2 Resistance of recombinant C.crenatum in times of culture transferred against phages

取传代次数分别为原代、20、40、60、80、100次的重组钝齿棒杆菌进行噬菌体抗性定量检测,通过噬菌体感染实验分析cglⅠ基因在传代过程中是否正常表达,以此考察重组质粒pJL23-cglⅠ在钝齿棒杆菌中的结构稳定性。由表2可以看出,重组钝齿棒杆菌在传代过程中一直保持抗噬菌体活性,与原代菌株相比,EOP均小于10-8。表明cglⅠ基因在重组钝齿棒杆菌株中稳定表达,即在传代培养过程中,重组质粒的结构稳定。

2.3 重组质粒pJL23-cglⅠ对钝齿棒杆菌生长的影响

从野生钝齿棒杆菌和重组钝齿棒杆菌的生长曲线可以看出(见图1),在相同培养条件下,野生钝齿棒杆菌培养到3 h左右便达到对数生长期,而重组钝齿棒杆菌达到对数期的时间约延迟1 h左右,但二者达到稳定期的时间趋于相同。总体上2个菌株的生长率相差不大,只是重组钝齿棒杆菌进入对数期生长速度要略晚于野生钝齿棒杆菌。

图1 野生钝齿棒杆菌和重组钝齿棒杆菌的生长曲线Fig.1 The growth curves of wild C.crenatum and recombinant C.crenatum

2.4 重组质粒pJL23-cglⅠ对钝齿棒杆菌产生谷氨酸的影响

由图2可以看出,重组钝齿棒杆菌和野生钝齿棒杆菌在发酵过程中谷氨酸积累量的变化趋势基本一致,具有相同的谷氨酸积累高峰,即在发酵32 h有最大的谷氨酸积累量,分别为277.74 mg/ L和261.39 mg/L,表明重组质粒pJL23-cglⅠ的导入并未影响钝齿棒杆菌的代谢产酸量。

图2 谷氨酸产生动力学曲线Fig.2 Dynamics curves of glutamate production

3 讨 论

对重组钝齿棒杆菌质粒稳定性的研究结果表明,重组菌株连续传100代次后,没有发生质粒丢失现象,且仍具有原代菌株的功能活性,表明重组菌株中的质粒具有结构稳定性和分离稳定性,推测重组质粒稳定性可能与质粒上携带的RM系统cglⅠ基因复合体有关。报道表明,一些Ⅱ型RM基因系统具有分离后杀死活性,可以介导维持质粒稳定性[8-11]。正常情况下,细胞中的M酶保护宿主染色体免遭R酶的致死性裂解。然而,一旦RM基因系统从细胞中被根除,随着细胞分裂,由于稀释,子代细胞中含有的M酶将越来越少,结果是M酶保护新复制的染色体上的许多识别位点的能力渐渐减弱。这样,染色体DNA上未被甲基化的位点将受到攻击,最终导致细胞死亡。同样,RM基因系统丢失后,随着细胞分裂,R酶也将被稀释。然而,M酶和R酶在作用方式上存在不平衡,也就是说,R酶杀死细胞时,只需染色体上一处断裂就可以充分有效(除非DNA被修复),而对于M酶而言,对宿主的保护,则需要染色体上上百个识别位点被甲基化[12]。虽然推测重组菌株的质粒稳定性与质粒上携带的RM基因复合体有关,但其确切原因和机制还有待进一步研究证实。

cglⅠ基因复合体在钝齿棒杆菌中表达后,首先通过甲基转移酶在特异识别序列上使宿主基因组DNA胞嘧啶甲基化,以避免相应限制酶的裂解。这样,宿主基因组DNA胞嘧啶被甲基化后,是否对重组棒杆菌的生长代谢产生影响尚不清楚。本实验结果显示,重组菌株达到对数期时间略晚于野生菌株,表明重组菌株对数期生长有些缓慢,但进入稳定期后两者趋于一致。分析原因可能有以下几方面:①重组质粒在宿主菌中复制、外源基因产物的表达增加了细菌细胞的代谢压力;②含有质粒的重组菌株需要更多的能量和营养合成更多的DNA、RNA和蛋白质等物质;③质粒的复制和表达也将与宿主细胞竞争可用的原料物质,从而影响细菌的生长速率[13-14]。

重组钝齿棒杆菌产生谷氨酸的研究结果表明,重组菌株和野生菌株在实验发酵过程中谷氨酸积累量的变化基本趋于一致,表明重组质粒的导入并未影响菌株的代谢产酸量。

[1]Sander M E.Bateriophages in industrial fer mentations.In:Webster R G,Granoff A(Eds.)[J].Encyclopedia of Virology. Lodon:Academic Press,1993:117-121.

[2]袁品坦.再谈噬菌体的污染及其预防[J].发酵科技通讯, 1999,28(4):22-27.

[3]胡永飞,李铁民,杨智勇,等.限制修饰系统cglⅠ赋予钝齿棒杆菌抗噬菌体功能活性[J].生物工程学报,2008,24 (5):760-765.

[4]余茂效,司穉东.噬菌体实验技术[M].北京:科学出版社, 1991:11-12.

[5]Kong J,Josephsen J.The ability of the plas mid-encoded restriction and modification system Lla B Ⅲ to protect Lactococcus lactis against bacteriophages[J].Lett Appl Microbiol,2002,34(4): 249-253.

[6]葛保胜,任育红,唐志红,等.表达重组别藻蓝蛋白质粒在工程菌株中的遗传稳定性研究[J].微生物学通报,2005,32 (4):37-41.

[7]沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第3版)[M].北京:高等教育出版社,1999:141-143.

[8]Nakayama Y,Kobayashi I.Restriction-modification gene complexes as selfish gene entities:Roles of a regulatory system in their establishment,maintenance,and apoptotic mutual exclusion[J].Proc Nat Acad Sci USA,1998,95(11):6442-6447.

[9]Naito T,Kusano K,Kobayashi I.Selfish behavior of restriction modification systems[J].Science,1995,267(5199):897-899.

[10]Kulakauskas S,Lubys A,Ehrlich S D.DNA restriction-modification systems mediate plasmid maintenance[J].J Bacteriol, 1995,177(12):3451-3454.

[11]Kusano K,Naito T,Handa N,et al.Restriction-modification systems as genomic parasites in competition for specific sequences [J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(24):11095-11099.

[12]Kobayashi I.Restriction-modification systems as minimal for ms of life.In:Pingoud A.(ed.),Restriction endonucleases[J]. Berlin,Ger many:Springer-Verlag,2004:19-62.

[13]Ricci JCD,Hernandez ME.Plasmid effects on Escherichia coli metabolism[J].Crit Rev Biotechnol,2000,20(2):79-108.

[14]Lee K,Moon SH.Growth kinetics of Lactococcus lactiss sp.diacetylactis harboring different plasmid content[J].Curr Microbiol,2003,47(1):17-21.

Physiological Stability of the Recombinant Corynebacterium cretanum with Phage Resistance

HU Yong-fei,L I Tie-min,ZHANG Bo,YANG Zhi-yong,LI Yu
(Sch.of Life Sci.,Liaoning Uni.,Shenyang110036)

In order to explore the feasibility to apply to an engineered phage-resistant Corynebacterium cretanum strain,a recombinant plasmid pJL23-cglI in C.crenatum and the effect of it on the growth metabolism of host cells was studied.The results showed that the recombinant plasmid pJL23-cglI stably maintained inC.crenatum,and the recombinant plas mid pJL23-cglI had some impact on the early growth of the recombinant C.crenatum,but no effect was found on its production of glutamate.

Corynebacterium cretanum;recombinant plas mid;plasmid stability;growth rate;glutamate

Q78

A

1005-7021(2010)06-0051-04

辽宁省科技厅自然科学基金(20082501);沈阳市科技局计划项目(1091187-1-00)

胡永飞 男,博士。研究方向为微生物生物工程。

＊通讯作者。Tel:024-62202232,E-mail:tieminli@lnu.edu.cn

2010-08-25;

2010-11-01