1株Alternariasp.真菌菌丝提取物对玉米种子发芽促进作用的研究

马晓颖,高 颖,贾东贝,李冰宇,丛 玲,王 娜,杨 涛＊

(1.沈阳农业大学土地与环境工程学院,辽宁沈阳 110161;2.辽宁省农业科学院生命科学中心,辽宁沈阳 110161)

1株Alternariasp.真菌菌丝提取物对玉米种子发芽促进作用的研究

马晓颖1,高 颖1,贾东贝1,李冰宇1,丛 玲2,王 娜2,杨 涛2＊

(1.沈阳农业大学土地与环境工程学院,辽宁沈阳 110161;2.辽宁省农业科学院生命科学中心,辽宁沈阳 110161)

从健康的野生山枣根部分离得到1株真菌,经分子鉴定其为支链孢属A lternariasp.并且对其进行液体培养到生长期后,菌丝体用4层纱布滤出,40℃烘干,研磨后用乙醇浸提3次,合并滤液,并测定其菌丝醇提取物的浓度,配成1、10、100μg/mL的浓度,进行玉米种子催芽试验。结果表明,浓度为1、10μg/mL的醇提取物,均可提高玉米种子的发芽指数,而浓度为100μg/mL的醇提取物则会降低玉米种子发芽指数。

真菌;提取物;玉米;发芽指数

真菌的次生代谢产物种类十分丰富,基本涵盖了所有化合物类型,包括生物碱、黄酮类化合物、芳香类化合物、挥发性物质、皂普、酚类、多炔类、异香豆素类等。在对次生代谢产物的分离纯化的研究中,分离得到各种类型的化合物。链格孢(Alternaria)是自然生态系统和农业生态系统中的重要成员,在自然界物质循环中起着一定作用。已有研究指出:在分离出来的数十种链格孢菌次生代谢产物中,除真菌毒素外,也有杀虫、杀菌和杀原生生物的活性物质存在[1]。有研究表明,从部分链格孢次级代谢产物中提取的蛋白能诱导植物产生系统抗性,促进植物生长,改善作物品质,可发展为新型的多功能生物农药[2]。如分离自1株菊池链格孢真菌的植物生长刺激素3,6-二羟基蜂蜜曲菌素,具有促进水稻秧苗根茎生长作用。本文从野生山枣根部分离出一种Alternaria sp.真菌,并用其醇提取物进行玉米种子的催芽效果试验,为微生物(链格孢)在多功能农药资源的开发提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 菌株的分离

将根系自土块中取出,轻轻抖动除去松散附在根上的土粒,称取10 g根系,置于盛100 mL无菌水的三角瓶中,振荡15 min,以洗下的土制成土壤浸提液。吸取各种植物的根际土壤浸提液制成不同浓度梯度的土壤浓度悬浮液,吸取10-3～10-5土壤浓度悬浮液0.1 mL(约2滴),加到孟加拉红分离培养基和PDA平板上,用灭菌涂布棒涂均匀,28℃恒温培养箱倒置培养3～7 d。

1.2 菌株的发酵

将分离得到的真菌接到平板PDA培养基上, 25℃培养5～7 d,用6 mm打孔器打孔,取3片接种于装有100 mL种子培养液(PDA培养基)的250 mL三角瓶,于28℃,140 r/min的旋转摇床上培养3 d作为种子液。将上述种子液以10%接种量接入装有200 mL发酵培养基(同种子培养液)的500 mL三角瓶中,同样条件下培养5 d,终止发酵,放入4℃冰箱中保存备用。

1.3 菌丝醇提取物的制备

将培养好的菌丝体洗涤后60℃下烘干,称重,然后用高速粉碎机粉碎,加入同体积乙醇用磁力搅拌器将其混匀搅拌24 h,浸提3次,真空抽滤,收集滤液备用。

1.4 催芽试验

将上述野生山枣菌菌丝醇提取物配成1、10、100μg/mL不同浓度对玉米种子进行催芽试验。将种子放在配好的不同浓度的醇提取物中,在28℃水浴1 h,然后在无菌的培养皿中放双层滤纸,每皿放7粒,加20 mL蒸馏水,每个浓度做2个重复,培养5 d。记录并计算出其发芽率、发芽指数和活力指标。

发芽指数=∑(在t日的发芽数/发芽日数)

活力指数=芽长×发芽指数

1.5 分子鉴定

利用CTAB法对筛选的真菌进行基因组DNA的提取,并且用1对通用引物ITS4与ITS5进行基因的扩增和测序。ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′,ITS5:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR反应体系为50μL,PCR buffering(Mg2+)加1/10,dNTPs各200μmoL/L,引物各0.2μmol/L,TaqDNA聚合酶1～2.5 U,模板100 ng,无菌双蒸水补足。反应条件为94℃预变性10 min,94℃变性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸2 min,共35个循环,72℃延伸10 min,保存产物检测使用的琼脂糖凝胶,电泳在凝胶成像系统进行电泳结果观察,浓度由上海生工生物工程有限公司纯化并测序。基于Blast搜索,选取与研究菌株序列最接近的种或最靠近的进化分支代表菌株的序列进行比对,利用DNAstar软件建立进化树。

2 结果与分析

2.1 菌株形态

在野生山枣根部筛出1株真菌S1(如图1左所示)。等径生长,初为白色,后渐变为青褐色至暗褐色,边缘整齐,呈波状或裂片状,在培养基表面可以看到有黑色的孢子堆形成。成熟的分生孢子具4～8个横膈膜,1～5个纵隔膜,倒棍棒形,卵形或椭圆形,幼时孢子为透明无色,成熟后呈黑褐色(如图1右所示)。

2.2 催芽试验

将上述野生山枣菌菌丝醇提取物配制成不同的浓度,对玉米进行催芽试验测试,野生山枣菌菌丝醇提取物对玉米种子萌发阶段的促进作用(如表1所示),浓度为1、10μg/mL的醇提取物,均可提高玉米种子的发芽指数,而浓度为100μg/ mL的醇提取物则会降低玉米种子发芽指数。

表1 不同浓度的提取物对玉米发芽的影响Table 1 The effect of different concentrations of extracts on the corn of germination

2.3 分子鉴定结果

图2(左)为从S1真菌中扩增DNA序列图。从图2(左)中可以看出引物ITS5和ITS4成功地扩增出S1菌株ITS区段,得到了特异性单一片段,而在对照中未扩增出任何片段,表明整个反应没有外来污染。该真菌基因组片段大小约为500 bp左右,且重现性较好。基于Blast搜索,选取与研究菌株序列最接近的种或最靠近的进化分支代表菌株的序列进行比对,利用DNAstar软件建立进化树(图2右)。结果表明S1真菌与Alternaria sp.的同源相似性达到99%。

图1 真菌S1的菌落形态(左),真菌S1的孢子形态(右)Fig.1 (Left)The colony of fungi S1,(right)The conidia of fungi S1

图2 S1真菌扩增DNA序列图(左),真菌S1通过ITS序列分析建立的系统发育进化树(右)Fig.2 Electrophoresis of amplifieation Produet fungi S1(left),Phylogenetic treesobtained from ITS sequencing analysis of fungi S1(right)

3 讨 论

提取溶剂的筛选:菌株菌丝体一般都采用有机溶剂进行提取,根据极性的不同,将菌丝体颗粒分别用正丁醇、乙酸乙酯、乙醇进行提取,采用每种溶剂浸提3次,将3种提取物挥干溶剂后再用乙醇溶解,分别进行提取物的催芽试验。结果如图3所示,乙醇溶解部分的活性成分催芽效果明显,这表明催芽的有效成分应该是极性较高的物质。

有效成分的确定:在本次试验中,利用真菌S1的醇提取物进行玉米种子的催芽,并产生了显著的效果,其作用机理和方式还未可知,其各个成分是联合作用还是某一单独的成分在起作用有待以后继续深入的研究。

图3 不同溶剂提取物对玉米发芽的影响Fig.3 The effect of different solvents of extracts on the corn of germination

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Effect of Alternariasp.Mycelium Extracts on Maize Seed Germination

MA Xiao-ying1,GAO Ying1,JIA Dong-bei1,LI Bing-yu1,CONG Ling2,WANG Na2,YANG Tao2
(1.Shenyang Agric.Uni.Land&Environ.Engin.,Shenyang110161;2.Liaoning Acad.of Agric.Sci.Ctr.of Life Sci.,Shenyang110161)

A fungal strain was isolated from healthy roots of wild hill date.And the result of molecular identification showed this fungus was Alternaria sp.Fermentation in liquid medium was done using this fungus to study the effect of products.Its mycelium was filtered with four layers of gauze after its growth.Then the mycelium was dried at 40℃and ground into powder and extracted with ethanol three times and put all filtrates together.The extract concentration was deter mined.Different concentrations of this extraction(1μg/mL,10μg/mL,and 100μg/mL)were used to study the effect on maize seed germination.The test of seed germination indicated that the germination index was improved under the concentration of 1μg/mL and 10μg/mL while the germination index was decreased under the concentration of 100μg/mL.

fungus,extract,maize,germination index

Q939.9;S154.3

A

1005-7021(2010)06-0039-04

辽宁省科技攻关项目(2009208001)

马晓颖 女,硕士研究生。现从事微生物肥料相关研究。E-mail:mxy851001@126.com

＊通讯作者。E-mail:smkxzx@sina.com

2010-11-06;

2010-11-20