禽蛋中泰乐菌素残留量的微生物学检测方法

玛尔江·木坎 库丽扎达·木拉提

试样经加水均质、离心后取上清液，进行杯碟法测定。利用被测样液中的泰乐菌素残留量与藤黄微球菌的作用产生抑菌圈，根据产生抑菌圈的大小用标准曲线法进行定量测定。

1 试剂和材料

1.1 缓冲液（pH值8.0±0.1）

称取13.3 g无水磷酸二氢钾加入900 ml水溶解，再加入100 ml 6.2%氢氧化钾溶液，混匀，于121℃高压灭菌15 min。

1.2 生理盐水

称取8.5 g氯化钠，溶于1 000 ml水中，于121℃高压灭菌15 min。

1.3 泰乐菌素标准品

1 006 μg/mg，由中国兽医药品监察所提供。

1.4 泰乐菌素标准储备液

称取适量的泰乐菌素标准品，先用少量甲醇溶解，再加水至 1 000 ml,使其浓度达 1 000 μg/ml，置 4 ℃冰箱保存，可使用8 d。

1.5 泰乐菌素标准工作液

吸取一定量泰乐菌素标准储备液，分别用缓冲液稀释成浓度为 0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μg/ml的标准工作液。需当天配制和使用。

1.6 培养基

1.6.1 培养基Ⅰ（pH值6.1±0.1）

蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏5.0 g，氯化钠2.5 g，琼脂15.0 g，加蒸馏水至1 000 ml，分装于试管或克氏瓶中，于121℃高压灭菌15 min；灭菌后可制成斜面。

1.6.2 培养基Ⅱ（pH值7.0±0.1）

蛋白胨 10.0 g，牛肉浸膏 5.0 g，氯化钠 2.5 g，加蒸馏水至1 000 ml，分装于试管中，于121℃高压灭菌15 min。

1.6.3 培养基Ⅲ（pH值8.5±0.05）

蛋白胨6.0 g，牛肉浸膏1.5 g，酵母浸膏3.0 g，葡萄糖1.0 g，胰水解酪蛋白4.0 g，琼脂15.0 g，加蒸馏水至1 000 ml，分装于锥形瓶中，于121℃高压灭菌15 min。

1.7 试验菌种

藤黄微球菌CMCC（28001）由中国生物药品检定所提供。

2 仪器和设备

牛津杯：不锈钢小管，外径（8.0±0.1）mm，内径（6.0±0.1）mm，高（10±0.1）mm。培养皿：直径约 90 mm，底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，具陶瓦盖。ZY-300Ⅳ多功能微生物自动测量分析仪。均质器：不低于10 000 r/min。离心机：不低于8 000 r/min。培养相：（36±1）℃，搁板应保持水平。高压灭菌器，恒温水浴锅：（恒温±1℃）。

3 方法

3.1 样液制备

将试样均质1 min（5 000 r/min）后，再称取20 g于离心管内，加入5 ml水，充分搅匀，放置60 min后，离心20 min（8 000 r/min），取上清液作为样液。

3.2 菌悬液的制备

用约3 ml培养基Ⅱ将培养基Ⅰ试管斜面上的藤黄微球菌培养物洗下，并移种到克氏瓶中的100 ml培养基Ⅰ的表面上，用灭菌玻璃珠使其均匀地铺于整个表面，在36℃培养24 h后，用约15 ml灭菌生理盐水洗下琼脂表面的培养物，制成菌悬液，置4℃冰箱中可保存2周。

3.3 检定用平板的制备

在测定前，需进行预测试验，以求得菌悬液最佳用量。用0.1 μg/ml泰乐菌素标准工作液对加有不同量的菌悬液的平板进行测试，经培养后能使0.1 μg/ml标准工作液在平板上产生直径大于或等于10 mm清晰、完整的抑菌圈的菌悬液用量为最佳用量。注入10 ml熔化的培养基Ⅲ于灭菌培养皿内，水平静止，使其凝固，再于已熔化并冷却至45～50℃的同一培养基内，加入最佳用量的菌悬液使之充分混合后，取约4 ml注入上述已铺有培养基Ⅲ的平板上，保持水平，使其凝固，所用平板需当天制备。

4 标准曲线回归方程

用泰乐菌素标准工作液制备标准曲线，以0.2 μg/ml浓度的标准工作液为参考浓度，以0.05 μg/ml浓度的标准工作液作阴性对照，每个标准工作液浓度取3个检定用平板作为一组，每个平板上置4个牛津杯，使牛津杯在半径为2.5 cm的圆面呈90°角间距，对角两个杯中加入0.2 μg/ml参考浓度标准工作液，另两个对角杯中加入另一种浓度的标准工作液。4个浓度标准工作液共12个检定平板，用于标准曲线。其中0.2 μg/ml参考浓度的标准工作液将得到24个抑菌圈直径的数值，而其他标准工作液分别得到6个抑菌圈直径的数值。盖好陶瓦盖，置（36±1）℃培养18 h。翻转平板，取出牛津杯，精确地测量各个浓度产生的抑菌圈直径，求得各自的平均值，再求出0.2 μg/ml参考浓度24个抑菌圈直径的平均值。

4.1 回收率试验

取空白禽蛋精密称取3份各20.0 g，分别加入浓度为 100 μg/ml标准液 0.5、1.0、2.0 ml，得到添加最终浓度为 8.00、4.00、2.00 μg/ml的添加阳性禽蛋，回收率计算公式：

4.2 重复性试验

取添加阳性试料(添加终浓度分别为2.00、4.00、8.00 μg/ml)各3份，按3.1节方法进行操作，每个浓度至少做3次重复，每次都要同时做标准曲线。

样品中泰乐菌素残留量计算公式为：

式中：X——试样中泰乐菌素的残留量（mg/kg）；

c——从标准曲线上查出的样液中泰乐菌素的浓度(μg/ml)；

m——每毫升最终样液所代表的试样量(g/ml)。

5 结果

5.1 线性关系

标准曲线回归方程为 y＝9.475 7x-14.049，r＝0.998 2，其中x为抑菌圈直径，y为10倍泰乐菌素溶液浓度的对数值。结果表明，泰乐菌素在0.1～0.8 μg/ml的浓度范围内，抑菌圈直径与效价浓度的对数值呈良好的线性关系，见表1。

表1 线性试验结果

5.2 回收率和重复性试验（见表2）

试验证明泰乐菌素在禽蛋中的回收率,达到残留检测方法要求的80%，检出重复性良好。

6 讨论与小结

①注意样品的污染。在测定抗生素残留量时，样品中抗生素溶液的浓度非常低，因此，取处理样液时要避免样品的损失，测定时所用的试验器具应严防抗生素残留和污染。

表2 泰乐菌素在禽蛋中的回收率和重复性试验结果

②在进行菌层预测试验时，试验用的菌种应保持新鲜、纯洁，菌种的活性，对抗生素反应灵敏，菌种对测定影响很大，若菌种不适合，将得不出正确的结果，菌种不新鲜影响生长速度及灵敏度，一般使用第三代菌种为佳。

③试验用培养基的灵敏度应高，应严格控制培养基的灵敏度。

④培养温度对菌种的生长和抑菌圈所致的直径大小有影响，32℃培养时菌层稀薄，颜色浅，抑菌圈边缘不清晰，36～37℃培养时菌层密实，颜色显黄，抑菌圈边缘清晰。

⑤本文通过调解菌悬液和培养基的使用量，完全可以是0.1 μg/ml的泰乐菌素标准液产生大于10.0 mm的抑菌圈，所以本法的灵敏度能满足农业部规定部颁标准的检测要求。

[1]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典一部[M].北京：中国农业出版社，2005（附录）：103-109.

[2]张治锬.抗生素药品检验[M]（第1版）.北京：人民卫生出版社，1987.

[3]中华人民共和国进出口商品检验行业标准SN0670—1997.