菌落多重PCR鉴定不同荚膜血清型的多杀性巴氏杆菌*

李伟杰,赵 耘,杜昕波,康 凯,陈 敏

(中国兽医药品监察所,北京 100086)

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是具有异质性特征的病原菌亚种群,常引起牛、猪、鸡、兔等家养动物和野生动物以败血症及呼吸系统疾患为主的疾病[1-2]。目前认为不同菌株之间在宿主亲嗜性、致病力、碳水化合物发酵、菌落形态和抗原特异性等方面具有明显差异[1,3]。由于荚膜血清型决定病原菌的免疫原性,各血清型之间交叉免疫保护性较低,对该致病菌进行荚膜分型就显得尤为重要[1]。1984年Carter G R等[2]提出多杀性巴氏杆菌血清型的标准定名,分为A、B、D、E和F 5个荚膜血清型。T ownsend K M等[4]研究表明,KMT1基因是Pm种特异性的片段。而荚膜生物合成位点hyaD-hyaC 、bcbD 、dcbF 、ecbJ 、fcbD 分别是 A 、B、D 、E、F血清型高度特异性的基因[3]。本试验拟对上述特定的基因序列选择不同引物进行扩增,研究多杀性巴氏杆菌种的鉴定和荚膜分型,以及与Biolog鉴定和传统血凝抑制试验的符合率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 多杀性巴氏杆菌参考菌株CVCC390(A 型)、CVCC391(B 型)、CVCC392(D 型)、CVCC393(E型)、CVCC395(F型)和多杀性巴氏杆菌 C44-2 、C44-10、C44-18、C44-44 、C44-49、C45-11、C46-11、C47-5、C48-3均由中国兽医药品监察所菌种室提供;支气管败血波氏杆菌CVCC2999、胸膜肺炎放线杆菌CVCC266、大肠埃希菌CVCC244、猪链球菌CVCC606、粪肠球菌A20由中国兽医药品监察所菌种保藏中心提供。

1.1.2 主要仪器及试剂 三洋CO2培养箱,Biolog细菌鉴定仪,Eppendorf PCR仪,北京六一电泳槽,Wealtec Dolphin-chemi凝胶成像系统,上海精宏隔水式培养箱;Taq DNA聚合酶,10×PCR buffer,dNTP,DNA Marker DL 2 000和琼脂糖购自宝生物工程(大连)有限公司;染料Goodview购自北京赛百盛基因技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养 将冻干保存的多杀性巴氏杆菌用马丁汤溶解后,接种改良马丁琼脂斜面(含40 mL/L马血清和1 g/L血红素),37℃过夜培养;支气管败血波氏杆菌、猪链球菌用马丁汤溶解,接种血琼脂斜面,37℃过夜培养;大肠埃希菌、粪肠球菌用普通肉汤溶解,接种普通琼脂斜面,37℃过夜培养;胸膜肺炎放线杆菌用TSB(含80 mL/L小牛血清和0.2 g/L NAD)溶解,接种 TSA(含 80 mL/L小牛血清和0.2 g/L NAD)斜面,体积分数为5%CO2环境中37℃过夜培养。取各菌种的斜面培养物划线接种相应的平板,37℃培养24 h,单菌落直接作为PCR反应的模板进行菌落PCR。

1.2.2 菌株的Biolog鉴定 Biolog鉴定操作见参照文献[5]。

1.2.3 菌株的Carter氏间接血球凝集试验 参照文献[6]用热处理法制备荚膜抗原,并制备10 mL/L致敏血球,利用Carter氏间接血球凝集试验检测荚膜抗原的类型。

1.2.4 PCR引物合成 参考文献[3-4]报道,由上海Invitrogen公司合成Pm种和型特异性引物序列,将各引物浓度稀释至25 μ mol/L,置-20 ℃保存备用。引物的序列、位置及扩增片段大小见表1。

表1 引物的序列与位置Table 1 The sequence and position of primer

1.2.5 PCR扩增 PCR反应体系为50 μ L,依次加入10×PCR 缓冲液(含 25 mmol/L MgCl2)5 μ L、6 对引物(25 μ mol/L)各 1 μ L 、dNT P(2.5 μ mol/L)4 μ L 、Taq 酶(5 U/μ L)1 μ L 、双蒸水 28 μ L,用微量可调移液器的枪头挑取培养24 h的多杀性巴氏杆菌的单菌落,悬浮于PCR反应液中。PCR反应条件为95℃5 min;94℃30 s,56℃30 s,72℃45 s,共30个循环;最后72℃10 min。PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.6 特异性检测 取动物鼻腔和肺组织中常见的支气管败血波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠埃希菌、猪链球菌和粪肠球菌,按上述方法进行PCR扩增,检测不同细菌种间PCR扩增的特异性。

2 结果

2.1 菌株的Biolog鉴定结果

14株菌株的Biolog鉴定结果表明,与多杀性巴氏杆菌的匹配程度最高,具体参数见表2。其中相似性(SIM)和位距(DIS)是2个重要的参数,表示测试结果与数据库相应数据的匹配程度。当SIM＞0.75,DIS＜5.0时,为良好的匹配;SIM 值越接近于1,鉴定结果的可靠性越强。通常在SIM值≥0.5时,就可以确定菌株的分类地位,从表2中可以看出这14株菌株均为多杀性巴氏杆菌。

表2 14株菌株的Biolog鉴定结果Table 2 The Biolog identification results of fourteen strains

2.2 菌株的Carter氏间接血球凝集试验结果

Carter氏间接血球凝集试验结果表明,CVCC390、C44-10、C44-18、C44-44、C48-3 为荚膜血清 A 型 ;CVCC391、C44-2、C45-11、C46-11、C47-5 为荚膜血清B型;CVCC392、C44-49为荚膜血清D型;CVCC393为荚膜血清E型;CVCC395为荚膜血清F型。

2.3 多杀性巴氏杆菌种和型特异性PCR结果

14株多杀性巴氏杆菌经Pm种引物进行PCR扩增,均扩增出 460 bp左右的DNA片段(图1),与预期设计的长度464 bp相符。而支气管败血波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠埃希菌、链球菌和粪肠球菌未扩增出相应片段。

14株多杀性巴氏杆菌经Pm型引物进行PCR扩增,结果见图1。菌株CVCC390、C44-10、C44-18、C44-44、C48-3扩增出1 000 bp左右的DNA片段,为荚膜血清 A 型;菌株 CVCC391、C44-2、C45-11、C46-11、C47-5扩增出760 bp左右的 DNA片段,为荚膜血清 B型;菌株 CVCC392、C44-49扩增出660 bp左右的 DNA片段,为荚膜血清 D型;菌株393扩增出510 bp左右的DNA片段,为荚膜血清E型;菌株395扩增出850 bp左右的DNA片段,为荚膜血清F型。PCR结果与Carter氏间接血球凝集试验结果完全相符。而支气管败血波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠埃希菌、猪链球菌和粪肠球菌均未扩增出相应的片段。

图1 菌株多重PCR结果Fig.1 The multiplex PCR results of strains

3 讨论

多杀性巴氏杆菌的荚膜血清型主要为A、B和D型。近年来采用核磁共振研究证实,A型菌株的荚膜成分是透明质酸[7],B型菌株的荚膜成分由阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖组成[2],D型菌株的荚膜成分含有肝素[8],F型菌株的荚膜成分含有软骨素[8-9],而E型菌株的荚膜成分至今还未搞清楚[2]。

本研究采用Pm种和型的特异性引物对多杀性巴氏杆菌参考菌株CVCC390(A型)、CVCC391(B型)、CVCC392(D 型)、CVCC393(E 型)、CVCC395(F型)和多杀性巴氏杆菌C44-2(B型)、C44-10(A型)、C44-18(A 型)、C44-44(A 型)、C44-49(D 型)、C45-11(B 型)、C46-11(B 型)、C47-5(B 型)、C48-3(A型)进行了扩增,与Biolog鉴定结果和Carter氏间接血球凝集试验结果相一致。同时对动物鼻腔和肺组织中常见的支气管败血波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠埃希菌、猪链球菌和粪肠球菌进行扩增,均为阴性,说明引物具有很强的特异性。

多杀性巴氏杆菌种和型多重PCR技术的建立,与传统的Carter氏间接血球凝集试验相比,缩短了鉴定时间,降低了工作难度。直接以菌落为模板进行菌落多重PCR,这与水浴煮沸法、SDS-蛋白酶K裂解法等相比,也节省了大量时间[10-11]。本方法的建立对于多杀性巴氏杆菌病的早期快速诊断,并及时防治以减少经济损失具有重要意义。

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