家兔实验性甘肃棘豆中毒的临床症状和病理形态学观察*

沈明华,莫重辉,赵宝玉,王占新

(1.青海大学农牧学院,青海西宁 810006;2.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨陵 712100)

棘豆是我国草原上对家畜危害最为严重的毒草之一,也是目前世界范围危害草原畜牧业发展最严重的毒草[1]。我国西北、西南及华北9个省(区)都发生过家畜棘豆中毒,棘豆种类超过20种,危害大且造成较大毒性灾害的主要有甘肃棘豆(Oxytropis kansuensis)、小花棘豆(O.glabra)黄花棘豆(O.ochrocephala)、冰川棘豆(O.glacialis)、宽苞棘豆(O.latiracteata)、急弯棘豆(O.def lexa)等,其分布面积超过800万hm2,每年因棘豆中毒所造成的经济损失高达10亿元以上,为我国的“三大毒草灾害”之一。棘豆不仅引起动物大批死亡,而且严重影响动物的繁殖机能,造成母畜不孕、流产、胎儿畸形,公畜性欲减退、精液品质下降等,妨碍畜种改良工作,已严重制约我国草原畜牧业的发展。前期研究证实,甘肃棘豆的主要毒性成分是苦马豆素(swainsonine)[2],其最初是由Colegate S M 等[3]从灰苦马豆(Swainsine canecens)中分离而命名,我国学者曹光荣等[4]首次从黄花棘豆中分离到主要有毒成分苦马豆素。现代毒理学研究表明,甘肃棘豆引起家畜中毒的机理是其主要有毒成分苦马豆素抑制了机体α-甘露糖苷酶的活性,引起体内低聚糖障碍而发生积聚,导致神经及内脏细胞广泛的空泡变性,尤以小脑神经元细胞、肝细胞、肾脏近曲小管上皮细胞和肾上腺皮质部球状带与髓质部上皮细胞空泡变性最为明显[5-10],从而使家畜表现为以神经机能障碍为特征的慢性中毒症状。顾百群等[11]、王凯等[12]分别观察了甘肃棘豆对山羊和绵羊的组织病理学变化,发现山羊和绵羊的脑、肾、肝、肾上腺、脾脏、淋巴等脏器都出现明显的空泡变性。王凯等[13]、李勤凡等[14]分别给实验家兔每天按每千克体重10 g剂量饲喂黄花棘豆和冰川棘豆,待出现典型中毒症状后,进行组织病理学检查发现,家兔心、肝、脾、肺和肾等组织细胞普遍出现空泡变性。然而有关甘肃棘豆对实验家兔的组织病理学变化尚未报道,本试验通过复制家兔实验性甘肃棘豆中毒模型,研究不同剂量甘肃棘豆对家兔组织学的影响,为甘肃棘豆毒理学研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 甘肃棘豆 甘肃棘豆地上部分全草2008年8月采于青海省湟源县日月乡,采时正值盛花期,晒干后运回粉碎备用。植物标本由青海大学农牧学院草业科学系孙海群教授鉴定。

1.1.2 实验动物 家兔 18只,体重 1.8 kg～2.3 kg,雌雄各半,购自于青海大学农牧学院教学实习牧场。试验前内服左旋咪唑3 mg/kg·w驱虫,临床观察2周,确认为临床健康后方可开始试验。

1.1.3 主要仪器与试剂 820型切片机,德国生产;904型磨刀机,美国生产;872型定时定温烤片台,浙江义乌生化仪器厂生产;Olympus Bx51型光学显微镜,日本生产;Olympus C3040-ADU型数码相机,日本生产;Olympus DP70型图象采集系统,日本生产;YP1200型电子天平,上海第二天平仪器厂生产;DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱,上海精宏实验设备有限公司生产;100 mL/L的中性福尔马林溶液、Ehrlich苏木素染液、10 g/L伊红染液、不同浓度酒精、二甲苯,均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 试验动物的分组与处理 18只家兔随机分成3组即Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组,每组6只,雌雄各半,试验前空腹称重,定为基础体重。Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组实验家兔分别按每日1、5、10 g/kg的剂量饲喂自配的甘肃棘豆草颗粒饲料(棘豆草粉40%、麦子15%、玉米15%、豆粕 15%、麸皮 14.5%、食盐0.5%),待采食完毕后,再添加基础日粮及少量干草,自由饮水。

1.2.2 基础日粮组成 基础日粮参照法国AEC(1987)家兔饲养标准,以玉米、麸皮、豆粕、玉米秸为主要原料,再补充骨粉、石粉、食盐、预混料、蛋氨酸等精确配制而成,基础日粮配方及营养水平见表1。

表1 基础日粮配方及营养水平Table 1 T he basal ration formulation and nutrition level

1.2.3 临床症状与病理学观察 每天观察各试验组家兔的饮食状态、精神状态、运动行为、排粪排尿等情况。每两周末称量各组实验家兔的体重。于连续饲喂甘肃棘豆草颗粒饲料的第120天,捕杀各试验组家兔,观察大体解剖变化,同时采取心、肝、肺、肾、大脑、小脑、淋巴结置于100 mL/L的中性福尔马林溶液中固定,常规石蜡包埋,间隔连续切片,H.E染色,光镜观察病理组织学变化。

2 结果

2.1 临床症状

在饲喂甘肃棘豆颗粒饲料后第18天,Ⅲ组1只怀孕母兔发生流产;Ⅱ和Ⅲ组试验家兔在第35天开始表现为精神沉郁、食欲轻度减退、反应较迟钝、后肢无力,喜卧等临床表现;Ⅰ组试验家兔在整个试验期间没有出现异常表现。

2.2 体重变化

由图1可见,Ⅰ组试验家兔仅在试验第42～70天时体重明显增加(P＜0.05或P ＜0.01);Ⅱ组、Ⅲ组试验家兔在整个试验期内体重与试验前比较均显著增加(P＜0.05或P＜0.01)。

图1 各试验组家兔体重变化Fig.1 Weight changes of rabbits in each group

2.3 病理学变化

2.3.1 大体剖检变化 Ⅰ组实验家兔的脾脏稍肿大,心脏、肝脏、肾脏等组织器官未见明显的眼观变化。Ⅱ组实验家兔的脾脏肿大,肝脏脆性增加,膀胱中尿液浑浊,其它器官未见到明显的肉眼变化。Ⅲ组实验家兔的脾脏明显肿胀,质地极度柔软;肝脏肿大,呈土黄色;肺脏气肿、呈苍白色、被摸紧张、边缘钝圆、有点状出血;右心室明显扩张、质地柔软、心室壁变薄;头盖骨疏松、脆性增大;肾脏轻微肿胀、切面稍外翻、被膜不易剥离。

2.3.2 病理组织学变化

(1)肝脏。Ⅰ组实验家兔肝细胞轻微肿大,肝窦状隙轻度变狭窄(图2A);Ⅱ组实验家兔肝细胞轻度肿大,颗粒变性,肝窦状隙明显变狭窄(图2B);Ⅲ组实验家兔肝小叶界限不清,肝窦隙变狭窄或闭塞,肝细胞索紊乱,并发生广泛严重的颗粒变性和空泡变性(图2C)。

图2 家兔肝脏病理组织学变化Fig.2 T he histopatholoical lesions in rabbit liver

(2)脑。Ⅰ组实验家兔脑血管周围间隙轻度增宽(图3A);Ⅱ组实验家兔部分小脑浦肯野氏细胞核溶解或消失,发生空泡变性(图3B);Ⅲ组实验家兔大脑血管扩张充血,血管周围间隙增宽,神经细胞核浓缩,溶解或消失,而发生空泡变性,可以看到卫星现象和噬神经现象。小脑浦肯野氏细胞大小和着色不一,胞浆内有细小的颗粒,细胞核坏死、溶解、消失,有空泡变性(图3C)。

图3 家兔小脑病理组织学变化Fig.3 The histopatholoical lesions in rabbit cerebella

(3)肺脏。3组实验家兔均表现肺充血,肺泡壁增生,间质增生,肺泡毛细血管上皮细胞浓缩、碎裂、溶解,肺泡壁断裂,肺泡增大(图4A、图4B和图4C)。

图4 家兔肺脏病理组织学变化Fig.4 The histopatholoical lesions in rabbit lungs

(4)肾脏。Ⅰ组实验家兔肾小球囊腔稍变狭窄,细胞核从基底膜上脱落、溶解,肾小管上皮细胞肿大发生空泡变性(图5A);Ⅱ组实验家兔肾小球体积稍增大,有轻度充血,肾小球囊腔变狭窄,肾小球部分血管壁上皮细胞轻度增生,发生颗粒变性,细胞从基底膜上脱落、溶解(图5B);Ⅲ组实验家兔肾小球体积增大、充血、肾小球囊腔变狭窄,肾小球血管壁上皮细胞增生,肾小管上皮细胞肿大发生颗粒变性、空泡变性、细胞破裂、管腔狭窄或阻塞、细胞核从基底膜上脱落、溶解、形成细胞管型、髓质部血管充血,间质增生(图5C)。

图5 家兔肾脏病理组织学变化Fig.5 The histopatholoical lesions in rabbit kidney

(5)脾脏。Ⅰ组实验家兔纤维素样变性,脾窦内有大量红细胞;Ⅱ组实验家兔脾窦内聚集了大量红细胞,脾小梁增生;Ⅲ组实验家兔被膜增厚,纤维素样变性,脾小梁增生,脾小体数量减少,脾窦内有大量红细胞。

(6)心肌。Ⅰ组实验家兔心肌部分横纹消失,其他未见明显病理变化;Ⅱ组实验家兔心肌部分横纹消失,心肌细胞颗粒变性;Ⅲ组实验家兔心肌纤维上有空泡,心肌部分横纹消失,心肌细胞颗粒变性,部分细胞较淡染,间质内有浆液性渗出液和纤维素性渗出液。

(7)淋巴结。Ⅰ组实验家兔未见明显病理变化;Ⅱ组实验家兔小梁增生,淋巴窦内有较多的淋巴细胞;Ⅲ组实验家兔皮质淋巴小结结构不明显,小梁增生,淋巴窦内有大量的淋巴细胞、单核细胞、纤维素渗出,以及少量含铁血黄素沉着。

(8)肠。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组实验家兔均未见明显病理变。

3 讨论

我国学者普遍认为甘肃棘豆中主要有毒成分为苦马豆素,其中毒机理主要是苦马豆素具有抑制动物体内α-甘露糖苷酶活性的作用,使体内的低聚糖在细胞内蓄积,导致细胞特别神经细胞发生空泡变性[11,15],从而表现为以中枢机能紊乱为特征的中毒症状。顾百群等[11]按10 g/kg剂量经瘤胃瘘管给山羊投服甘肃棘豆粉,当受试羊出现典型的中毒症状后,病理组织学检查发现山羊脑、肝、肾、心、胰等脏器有不同程度的损害作用,主要以细胞的空泡化变性为特征。从本试验组织病理学观察可以看出,实验家兔的心、肝、肺、肾、大脑、小脑、淋巴结均有不同程度的损伤,特别是脑变化较明显,而且甘肃棘豆的剂量越大这种损伤越明显,其组织学病理变化主要以神经细胞广泛性空泡变性为特征,这和顾百群等山羊甘肃棘豆中毒后组织学病理变化描述的相似,但没有山羊明显,这可能是山羊对甘肃棘豆的敏感性比实验家兔高有关。

我国学者分别从甘肃棘豆、黄花棘豆、冰川棘豆等棘豆属植物中分离出苦马豆素,含量分别为0.021%、0.012%、0.002%[4、16-17]。王凯等[13]、李勤凡等[14]报道家兔分别按每日10 g/kg饲喂黄花棘豆和冰川棘豆草粉后,实验家兔40 d后均出现棘豆中毒症状,心、肝、肺、肾、大脑、小脑、淋巴结均有不同程度的损伤,特别是脑变化较明显。本试验中实验家兔分别按每日1、5、10 g/kg剂量饲喂甘肃棘豆草颗粒后,Ⅱ组、Ⅲ组实验家兔在试验第35天开始出现的甘肃棘豆中毒症状,上述器官组织也有不同程度的损伤,和王凯等、李勤凡等报道描述的相似,但本试验中Ⅱ组、Ⅲ组实验家兔甘肃棘豆中毒症状明显比家兔黄花棘豆和冰川棘豆中毒症状出现的时间提前,这可能甘肃棘豆中主要有毒成分苦马豆素含量比黄花棘豆和冰川棘豆高有关,这也可从甘肃棘豆引起的组织学病理变化比黄花棘豆和冰川棘豆引起的组织学病理变化明显支持上述观点。Ⅰ组实验家兔没有出现异常变化,但组织器官受到一定程度的损伤,说明给实验家兔按每日1 g/kg剂量饲喂甘肃棘豆后,对实验家兔具有一定的毒性作用。

丁伯良等[2]对 9只怀孕关中奶山羊按每日10 g/kg体重剂量饲喂甘肃棘豆粉,孕羊在饲喂甘肃棘豆后第10～43天全部陆续流产,流产的为弱羔、死胎、畸胎或腐败胎,组织学观察发现卵巢黄体细胞、卵泡细胞和胎盘滋养层细胞胞浆广泛性空泡变性,而且从中毒怀孕羊胎水和胎盘中检测出苦马豆素,证明苦马豆素能损害胎盘并通过胎盘屏障直接损害胎儿。本试验中在饲喂甘肃棘豆颗粒饲料后第18天Ⅲ组1只怀孕母兔发生流产,这是否也是甘肃棘豆中主要有毒成分苦马豆素损害胎盘并通过胎盘屏障直接损害胎儿引起的,还有待于进一步深入研究。

刘诩中等[18]对甘肃棘豆营养成分进行了测定,结果表明甘肃棘豆中粗蛋白含量为13%～16%,与优质苜蓿营养价值(优质苜蓿粗蛋白含量为15%)相当,粗纤维含量24%～27%,与苜蓿粉相近,Ca、P含量也较高,由此可见,甘肃棘豆具有丰富的营养价值。李建科等[19]报道,当甘肃棘豆添加剂量为每千克体重24 g时,小鼠临床反应、体增重、食物利用率及血液学指标等未出现明显变化,说明此剂量为甘肃棘豆对小鼠的最大无作用剂量;王凯等[20]报道将甘肃棘豆粉按每千克体重10 g给实验羊进行间歇饲喂(间歇两周),实验羊在70 d内未出现任何甘肃棘豆中毒症状(对照组实验羊18 d开始出现甘肃棘豆中毒症状),说明间歇两周饲喂甘肃棘豆可以较好地预防羊甘肃棘豆中毒的发生,同时还能利用甘肃棘豆的营养成分;杨具田等[21]将甘肃棘豆剂量控制在日粮10%以内饲喂肥育猪,在整个试验期内未出现任何不良反应或中毒症状,屠宰后未发现异常,肥育猪血液学指标也没有变化,表明甘肃棘豆作为杂食动物的饲料,添加量控制在日粮10%以内是安全的。从本试验实验家兔体重变化来看,Ⅱ组、Ⅲ组实验家兔体重与试验前比较都有所增加(P＜0.05或P＜0.01),和上述资料报道相似,但Ⅰ组仅在试验第42～70天时体重明显增加(P＜0.05或P＜0.01),说明随着甘肃棘豆摄入量的增加,体重增加,剂量效应明显。同时从甘肃棘豆中毒症状出现的时间、中毒程度、体重变化等可以看出实验家兔对甘肃棘豆具有一定的耐受性,这也为甘肃棘豆作为啮齿动物饲料开辟一个新的途径。

致谢:本试验承蒙莫重辉副教授及梁林、拉毛、张旦梅、郭霞霞、刘冰存、晁永亮等同志的大力协助,在此表示衷心感谢!

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