扶正升血颗粒对荷瘤小鼠NKC-IFN-IL-2免疫调节网的影响

许惠敏，郭红云，张桂琼，黄邦荣，张永东，梁 涛，李雪萍，胡清荣，王玉梅

（甘肃省医学科学研究院药理毒理实验中心，甘肃 兰州 730050）

扶正升血颗粒对荷瘤小鼠NKC-IFN-IL-2免疫调节网的影响

许惠敏，郭红云，张桂琼，黄邦荣，张永东，梁 涛，李雪萍，胡清荣，王玉梅

（甘肃省医学科学研究院药理毒理实验中心，甘肃 兰州 730050）

目的 探讨扶正升血颗粒对荷瘤小鼠NKC-IFN-IL-2免疫调节网的影响。方法 建立小鼠移植性肝癌（H22）模型，将小鼠随机分为5组，分别为扶正升血颗粒低、中、高剂量组，阳性对照组和模型对照组，同时设正常对照组。经口灌胃给药10 d，采用乳酸脱氢酶释放试验测定NK细胞活性；用双抗体夹心ELISA法测定脾淋巴细胞培养上清液中IL-2和IFN-r的浓度。结果 扶正升血颗粒可增强荷瘤小鼠NK细胞的活性，同时提高IL-2和IFN-r的水平。结论 扶正升血颗粒对NKCIFN-IL-2免疫调节网可起到正向调节作用。

扶正升血颗粒；荷瘤小鼠；NKC-IFN-IL-2免疫调节网

近几年,国内外在单味药和其所含的单体成分的免疫调节作用方面研究较多[1]，而对复方研究较少。但是复方的复杂成分具有单味药和单体成分所不具备的药效整体性和互补作用，其可使疗效增强，毒副作用减少。扶正升血颗粒是我国著名中西医结合专家裴教授拟定的临床验方之一，该方经30余年的不断实践，显示出较好的疗效。本研究应用现代药理学研究方法探讨扶正升血颗粒对荷瘤小鼠NK细胞和细胞因子的影响，阐释其对荷瘤小鼠NKC-IFN-IL-2免疫调节网的作用，为今后其在肿瘤的治疗方面以及进一步开发应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验药品

扶正升血颗粒，由人参须、北沙参、太子参、潞党参等组成,由甘肃省医学科学研究院提供,每包含生药36.25 g。贞芪扶正升血颗粒，由定西制药厂生产；硝基氯化四氮唑蓝（NBT）、氧化型辅酶 I、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）、刀豆蛋白 A（ConA）、脂多糖LPS均为Sigma公司产品；RPMI-1640培养液为美国GIBCO产品；淋巴细胞分离液由天津生物技术开发中心生产；小鼠IL-2 ELISA试剂盒、小鼠IFN-r ELISA试剂盒由北京晶美生物工程有限公司生产。

1.2 实验动物

BALB/c小鼠，SPF级，雌雄兼有，体重18～20 g，购自甘肃省医学科学研究院实验动物中心，动物许可证号为SCXK（甘）2006-0010。实验室环境：温度为20℃～22℃，相对湿度为40%～50%，环境设施合格证号为SYXK[甘]2006-0010号。

1.3 瘤株

小鼠移植性肝癌（H22）瘤株,小鼠淋巴瘤（YAC-1）细胞株，由北京药物所引进，甘肃省医学科学研究院药理毒理实验中心保种。

1.4 实验仪器

SW-CJ-IF生物净化工作台（苏州）、SHEL-LAB1825TCCO2培养箱（美国）、TDL5M台式大容量冷冻离心机（长沙）、Multiskan MK3酶标仪（Themo Labsystems）。

1.5 实验方法

1.5.1 肿瘤模型建立[2]取接种肝癌（H22）瘤株7～8 d小鼠的腹水,用生理盐水稀释，台盼蓝染色后计数，将活细胞数调至2×106/ml左右的瘤细胞悬液接种在小鼠右腋皮下,每只接种0.2 ml。

1.5.2 分组及给药方法 接种次日将小鼠分为5组，分别为扶正升血颗粒低剂量组2.5 g/kg（相当于人临床用量的5倍，低剂量组）、扶正升血颗粒中剂量组5.0 g/kg（相当于人临床用量的10倍，中剂量组）、扶正升血颗粒高剂量组10.0 g/kg（相当于人临床用量的20倍，高剂量组）、模型对照组和阳性对照组（给予贞芪扶正颗粒1.7 g/kg，相当于人临床用量的10倍），同时设正常对照组。每组小鼠8只，雌雄各半。接种次日按设定剂量开始给药,各治疗组灌胃给予0.2 ml/10 g体重的药物，模型对照组和正常对照组给予等容量的蒸馏水，每日1次，连续给药10 d。

1.5.3 NK细胞活性测定[3]小鼠接种、分组及给药方法同上。末次给药后1 h，放血处死小鼠，无菌取脾，放入PBS液中涮洗后，用载玻片轻轻捻碎，吸取3 mlPBS液冲洗载玻片，用滤网（200目）过滤至小青瓶中，再将其沿管壁缓缓转入预先装入3 ml淋巴细胞分离液的离心管中离心（4℃ 3000 rpm，20 min）,吸取淋巴细胞分离液层细胞至离心管中，加PBS液洗2次，用RPMI-1640培养液调细胞浓度至1×107/ml。实验前24 h将靶细胞YAC-1进行传代培养，用前以Hank’s液洗3次，用RPMI-1640培养液调细胞浓度至4×105/ml。取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比50：1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5%Triton-100各100μl，上述各项均设3个平行孔，置37℃、5%CO2的培养箱中培养4 h，然后将96孔培养板以1500 r/min离心5 min，每孔吸取上清液100μl置96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，室温反应3～10 min，每孔加入1 mol/L的HCl30μl，于酶标仪490 nm处测定光密度值（OD），按下式计算NK细胞活性。NK细胞活性（%）=（反应孔OD-自然释放孔OD）（/最大释放孔OD-自然释放孔OD）×100%。

1.5.4 脾淋巴细胞IL-2和IFN-r的诱生与测定 小鼠接种、分组及给药方法同上。取上述方法制备的脾淋巴细胞悬液，调细胞浓度至1×107/ml，加入48孔板中，每孔0.9 ml，同时每孔加入含ConA的培养液100μ（lConA的终浓度为5μg/ml），置37℃含5%CO2的培养箱中培养36 h，收集上清液，按小鼠IL-2 ELISA试剂盒说明操作进行测定。另取上述制备的脾淋巴细胞悬液，加入48孔板中，每孔1 ml，同时加入终浓度为5μg/ml的LPS，置37℃ 含5%CO2的培养箱中培养24 h，收集上清液，按小鼠IFN-r ELISA试剂盒说明操作进行测定。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 扶正升血颗粒对荷瘤小鼠脾NK细胞活性的影响（见表1）

表1 扶正升血颗粒对荷瘤小鼠脾NK细胞活性的影响（n=8±s）

表1 扶正升血颗粒对荷瘤小鼠脾NK细胞活性的影响（n=8±s）

注：与正常对照组比较，▲P<0.05；与模型对照组比较，*P<0.05

2.55.010.01.7组 别 剂量（g/kg） NK细胞活性（%）正常对照组模型对照组扶正升血颗粒低剂量组扶正升血颗粒中剂量组扶正升血颗粒高剂量组阳性对照组--36.2±3.119.7±2.2▲22.2±4.0▲24.3±3.3▲*25.0±3.2▲*25.9±2.5▲*

模型对照组小鼠脾NK细胞活性明显低于正常对照组。各治疗组小鼠脾NK细胞活性较模型对照组均有所提高，扶正升血颗粒高、中剂量组与模型对照组比较，有显著性差异（P＜0.05）。

2.2 扶正升血颗粒对荷瘤小鼠脾细胞IL-2和IFN-r的影响（见表2）

表2 扶正升血颗粒对荷瘤小鼠脾细胞IL-2和IFN-r的影响（n=8±s）

表2 扶正升血颗粒对荷瘤小鼠脾细胞IL-2和IFN-r的影响（n=8±s）

注：与正常对照组比较，▲P<0.05，与模型对照组比较，*P<0.05

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模型对照组小鼠IL-2和IFN-r的量明显低于正常对照组。各治疗组小鼠IL-2和IFN-r的量较模型对照组均有所提高，扶正升血颗粒高剂量组IL-2的量与模型对照组比较，有显著性差异（P＜0.05），扶正升血颗粒高、中剂量组IFN-r的量与模型对照组比较，有显著性差异（P＜0.05）。

3 讨论

机体抗肿瘤的免疫机制十分复杂，涉及多种免疫成分。细胞因子是由活化的免疫细胞和一些基质细胞分泌的小分子蛋白。细胞因子本身就是一个复杂的网络，在免疫应答的启动、传递和调节中发挥着重要的免疫调控作用，很多中药都能促进细胞因子的分泌[4]。在机体的免疫系统中，免疫细胞之间、免疫分子之间、免疫细胞与免疫分子之间相互影响，彼此调节，构成了精细复杂的调节网络，共同维持机体的免疫平衡和自身稳定。有文献报道[5]，NKC-IFN-IL-2免疫调节网当数重要网络之一，并与MФ-IL-1-Th1免疫调节网密切相关。在NKC-IFN-IL-2免疫调节网中，IL-2对调节NKC活性和IFN-r的产生起着重要作用。NKC表面有IL-2受体（IL-2R），在丝裂原或抗原诱导下TH分泌的IL-2与NK细胞上的IL-2R结合，促进NKC分泌IFN-r，并使之继续分裂增殖。IFN-r又可作用于NK细胞的前体细胞使之合成和表达IL-2R，从而接受IL-2的作用而继续增殖。IL-2和IFN-r除可使更多的NK细胞激活外，还可参与T细胞、B细胞及其他免疫细胞介导的免疫应答过程。因此，NKC-IFN-IL-2免疫调节网具有十分广泛的免疫调节作用。肿瘤患者产生IL-2的能力低下，并伴随着IFN-r的产生减少和NK细胞活性的降低，可见NKC-IFN-IL-2免疫调节网与肿瘤密切相关。

本研究结果显示，荷瘤小鼠NK细胞活性降低，同时产生IL-2和IFN-r的能力低下，而扶正升血颗粒可增强荷瘤小鼠NK细胞的活性，同时提高IL-2和IFN-r水平，表明扶正升血颗粒对NKC-IFN-IL-2网络可起到正向调节作用，为其抗肿瘤效应奠定了理论基础。

[1]张群，雷林生，关曙光.糖类药物作用的受体及信号转导机制的研究进展[J].中草药，2005，36（4）：614～616.

[2]徐叔云，卞如廉，陈修.药理实验方法学[M].第3版.北京:人民卫生出版社，2002.

[3]中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范（2003年版）[S].2003.

[4]何跃生.中草药免疫调节剂及抗肿瘤作用研究进展[J].职业与健康,2005，21（10）：1454～1456.

[5]贺怀新，席孝贤.中医药免疫学[M].北京:人民卫生出版社，2002.

G424.31

B

1671-1246（2010）16-0081-02

甘肃省中医药管理局资助项目（2006-17）