浙江省热原检查用兔敏感性状况调查

朱社敏，王 丹，杨 珉，何忠平，匡 荣

(1.浙江省食品药品检验所，杭州 310004;2.金华市药品检验所，金华 321000)

浙江省热原检查用兔敏感性状况调查

朱社敏1，王 丹1，杨 珉1，何忠平2，匡 荣1

(1.浙江省食品药品检验所，杭州 310004;2.金华市药品检验所，金华 321000)

目的 调查浙江省热原检查用兔对细菌内毒素的敏感性情况，为提高热原检查结果的准确性和可靠性提供参考。方法 对全省所有取得生产许可证单位的家兔，用国家颁发的细菌内毒素标准品，“热原检查法”进行检查，剂量分别为5 EU/Kg和10 EU/Kg，记录并比较各单位家兔的平均升温值和升温率。结果 对细菌内毒素，各兔场家兔的敏感性有一定的差异。静脉注射5 EU/kg，平均升温值为0.40℃～0.87℃，升温率为35%～83%;静脉注射10 EU/kg，平均升温值为0.74℃～1.16℃，升温率为70%～94%。结论 不同生产单位的家兔对细菌内毒素的敏感性不同，有必要对热原检查用家兔进行细菌内毒素敏感性检查。

热原;家兔;敏感性;细菌内毒素

热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。虽然热原检查是最接近临床的，但影响实验结果的因素很多［1］。早期由于对实验动物、饲养条件没有统一要求，影响因素主要集中在动物的管理、实验环境等方面，随着饲养条件、实验环境要求的逐步提高，管理的规范化、标准化，有许多影响实验结果的因素已可以被排除，如饲养方式、饲料、检查前动物的禁食情况、实验环境等。但有些因素仍然存在，其中最主要的就是家兔的敏感性问题，因此，我们对浙江省取得家兔生产许可证的5家家兔繁殖场的家兔用细菌内毒素进行了敏感性测定。

1 材料和方法

1.1 实验动物

家兔(新西兰)，等级:普通级，体重 1.7～2.5 kg，雌雄各半，饲养条件:温度 21℃～24℃，湿度40%～70%，饲养条件、实验条件均满足《中国药典》2005年版二部附录［2］要求。动物 1只/笼饲养于不锈钢实验笼RB35型(长×宽×高:350mm×500mm×320mm)中;三层摆放，每层5个兔笼。不限量自由摄取水和食物。正式实验前一小时开始禁食、禁水，实验过程中不进食、进水。兔场生产许可证号分别为:SCXK(浙)2006－0024;SCXK(浙)2006－0025;SCXK(浙)2006－0026;SCXK(浙)2008－0036;SCXK(浙)2009－0039。

1.2 实验试剂

1.2.1 细菌内毒素国家标准品:批号:981，规格:9000单位/支，中国生物制品检定所。临用时，用细菌内毒素检查用水配成5 EU/mL的溶液。根据给药剂量要求，分别给药1mL/kg(5 EU/kg)或2mL/kg(10 EU/kg)。

1.2.2 细菌内毒素检查用水:批号:0807090，规格:100mL/瓶，湛江安度斯生物试剂有限公司。

1.3 实验仪器

热原测温仪:ZRY－2D型智能热原测定仪(天津天大天发科技仪器有限公司)。

1.4 实验分组与方法

实验用家兔购入后，在相同环境下饲养5～7 d，按《中国药典》2005年版二部附录“热原检查法”进行预实验，按热原检查兔使用标准判断家兔是否符合试验的要求。对首次测试不合格的家兔，休息2～3 d后，再次进行测试。在新兔选择后2～5 d，按“热原检查法”中热原检查程序，以注射细菌内毒素前所测得2次体温的平均值为基础体温，进行家兔基础体温测定。每个兔场取基础体温符合试验要求的家兔36～40只，按性别随机分成雌雄各2组，每组8～10只，经家兔耳缘静脉注射细菌内毒素，剂量分别为按体重给予细菌内毒素国家标准品5 EU/kg或10 EU/kg，注射后，按照热原检查要求继续家兔体温测试，每30 min测试一次，共测温6次，测温结束后，以给药后动物最高升温值为该兔最大升温值，计算各组家兔的平均最大升温值(均温)，没有升温只有降温的均以0计;以最大升温值≥0.6℃的家兔为升温兔，统计各单位升温动物数并计算升温动物数的百分率(升温率)。除兔场1外，所有实验均由相同人员在相同环境中进行，兔场1由相同人员在兔场1实验室环境中测定。

1.5 数据处理方法

实验数据以平均值±标准差表示，计量资料分析采用DAS统计软件中多组均数分析法进行，计数资料分析采用DAS统计软件中智能化两组有效率分析法进行。

2 结果

2.1 不同来源家兔新兔合格率测试

不同来源家兔新兔测试合格率不同，首次测试合格率和总合格率的差异均 显著(P＜0.05或P＜0.01)，重复测试可提高家兔的合格率(表1)。

表1 不同来源家兔新兔合格率测试结果Tab.1 Testing results of qualification rate of rabbits from different farms

2.2 不同来源家兔基础体温的测试

有文献报道，家兔基础体温与热原的敏感性有关，兔温低的较为敏感，兔温高的较为不敏感［3］。测试结果表明，各兔场的基础体温虽有一定的差异，但主要都分布在38.4℃～39.0℃(表2)。

表2 不同来源家兔基础体温测试结果Tab.2 Testing results of basal body temperature of rabbits from different farms

2.3 家兔静脉注射5 EU/kg细菌内毒素的实验结果

静脉注射5 EU/kg细菌内毒素后，动物总体的平均最大升温值为0.58℃，升温率为53%。各兔场家兔的平均最大升温值和升温率均存在有显著性意义的差异(P＜0.05或P＜0.01)。其中兔场1最敏感，平均升温值达0.87℃，升温率为83%，而最低的兔场 2，平均升温值只有 0.40℃，升温率仅为35%(表3)。

2.4 家兔静脉注射10 EU/kg细菌内毒素的实验结果

静脉注射10 EU/kg细菌内毒素后，动物总体的平均最大升温值为0.91℃，升温率为82%。各兔场家兔的平均最大升温值仍存在显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。但升温率除兔场1与兔场2的雄性兔仍存在显著性差异(P＜0.05)，其余的差异均不显著(P＞0.05)(表4)。

3 讨论

家兔热原检查法自1912年首次提出，1923～1925年得到发展。1942年美国药典首次收载了热原试验(pyrogen test)，将热原试验作为检查药品注射液的发热物质，其后各国药典也均收载了这一方法，成为经典的热原检查法。同样，1953年第一版《中国药典》中就收载了热原检查法，半个多世纪以来，热原检查法作为一种质控的重要手段，为保障人民用药安全作出了极大的贡献。

表3 不同来源家兔静脉注射5EU/kg细菌内毒素的实验结果Tab.3 Testing results of body temperature of rabbits injected intravenously with endotoxin at 5 EU/kg body weight from different farms

表4 不同来源家兔静脉注射10EU/kg细菌内毒素的实验结果Tab.4 Testing results of body temperature of rabbits injected intravenously with endotoxin at 10 EU/kg body weight from different farms

不同品种、来源的家兔对热原的敏感性不同;即使是同一品种、同一来源的家兔，经不同的实验动物生产单位自繁自育后，也可能会对热原的敏感性不同［1］。目前，浙江省内热原检查使用的家兔品种主要为新西兰种，种群主要来源于上海，经过各兔场的自繁自育后，热原的敏感性呈现出较大的差异，这是因为目前各实验动物生产单位基本上均为封闭式管理，实验动物生产单位间的交流较少，而各单位选择自繁母兔的方法也不一致。以兔场1为例，兔场1系一小型的家兔养殖场，自繁自育生产的家兔，从不对外供应，仅用于本单位的热原检查。饲养条件相对稳定、人员管理比较规范，在选择母兔时，特别注重基础体温的范围及波动情况;品种的纯度相对较高，因此该单位家兔的新兔合格率及对细菌内毒素的敏感性都保持了较高的水平。

不同单位生产的家兔对细菌内毒素的敏感性不同，受基础体温影响较小。基础体温偏高的家兔并非对细菌内毒素敏感性最差，而敏感性最差单位的家兔基础体温，如兔场2、3，其基础体温基本都在38.0℃～39.0℃之间。

不同家兔性别对细菌内毒素的敏感性可能不同［4］，但性别的影响更取决于家兔的来源。对兔场2来说，雌性家兔的敏感性明显高于雄性，而对兔场3来说，正好相反，雄性家兔的敏感性明显高于雌性。

药品注射剂的热原检查，是保证静脉注射药品安全的重要检查项目之一，其结果的准确与否，直接关系到临床的用药安全。家兔对细菌内毒素的敏感性直接决定了实验结果的准确性。由于各单位使用家兔的来源不同，对细菌内毒素的敏感性不一致，造成实验结果的不一致。使用高敏感性的家兔，可以更好的保障人民用药的安全，但有时也会带来一定的麻烦:兔场1就遇到过本单位检查不合格，复核单位检查合格的尴尬事件。而家兔对细菌内毒素的敏感性过低，将直接造成“假阴性”的结果，将失去热原检查的保障作用，严重影响人民的用药安全。因此，建议尽早建立热原用兔细菌内毒素的敏感性检查方法，并对全国各热原用兔提供单位的家兔实施检查，以提高热原检查结果的准确性。各热原用兔提供单位，应重视实验动物的遗传质量，规范繁育方法，淘汰敏感性低的家兔，以保证热原实验用兔对细菌内毒素的敏感性。

［1］徐长金.影响家兔法检查热原的诸因素［J］.中国医院药学杂志，1985，5(8):27－28.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典(2005版)［S］.2005.二部附录.

［3］李成章.热原检查中某些影响因素的探讨［J］.药学通报，1982，17(8):11－12.

［4］徐文瑜，任珺，杜颖，等，家兔性别与体温变化对热原检测结果的影响［J］.实验动物科学与管理，2006，23(3):22－25.

Investigation of the Sensitivity of the Rabbits for Testing Pyrogen in Zhejiang Province

ZHU She－min1，WANG Dan1，YANG Min1，HE Zhong－pin2，KUANG Rong1
(1.Zhejiang Institute for Food and Drug Control，Hangzhou 310004，China;2.Jinhua Institute for Drug Control，Jinhua 321000，China)

Objective To investigate the sensitivity to bacterial endotoxin of the rabbits for testing pyrogen(RTP)in Zhejiang province.Methods The rabbits from all the farms that obtained production license in Zhejiang province were administrated with two doses of endotoxin(5 EU/kg and 10 EU/kg).The average value and percentage of temperature elevated of the rabbits from different farms were recorded and compared in the pyrogen test.Results There were some differences on the sensitivity of RTP to bacterial endotoxin form different farms.When the rabbits were injected the endotoxin intravenously of 5 EU/kg or 10 EU/kg respectively，the average value of temperature were 0.40℃～0.87℃ or 0.74℃～1.16℃ and the percentage of temperature elevated were 35%～83%and 70%～94%.Conclusion Different rabbits from different farms show different sensitivity to bacterial endotoxin.It is necessary to test the sensitivity of RTP to bacterial endotoxin.

Pyrogen;Rabbits;Sensitivity;Bacterial endotoxin

R332

A

1671－7856(2010)07－0086－05

2010－03－02

浙江省科技计划项目 (NO.2008F80023)。

朱社敏，女，主任药师，研究方向:药检药理。E－mail:CNCZSM@126.com

匡荣，副主任药师，研究方向:药检药理。E－mail:kuangrongyjs@hotmail.com