TGF－β1对不同阶段哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞增殖的作用

2010-09-17蔺鹏翔张焕萍张爱芝

中国比较医学杂志 2010年7期

关键词：平滑肌重塑气道

蔺鹏翔，张焕萍，张爱芝

(1.山西医科大学，太原 030001;2.山西医科大学第一临床医学院呼吸内科，太原 030001)

TGF－β1对不同阶段哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞增殖的作用

蔺鹏翔1，张焕萍2，张爱芝1

(1.山西医科大学，太原 030001;2.山西医科大学第一临床医学院呼吸内科，太原 030001)

目的探讨TGF－β1对不同阶段哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖的作用。方法建立2周、6周哮喘大鼠模型，分别以 1μg/L、10 μg/L和 100 μg/L TGF－β1干预 ASMCs生长。采用流式细胞仪、MTT法检测ASMCs增殖情况，观察不同浓度TGF－β1对 ASMCs增殖的影响。结果 2周和6周哮喘组 ASMCs的 S期比例、A值分别为(34.31±1.41)%、(35.96±3.46)%;(0.546±0.005)、(0.559±0.009)与对照组(12.24±2.64)%、(0.289±0.009)比较均显著增高(均 P＜0.01)。2周、6周哮喘模型组的各 TGF－β1干预组 ASMCs的 S期比例、A值与各自哮喘组比较均显著升高(均 P ＜0.01)，10 μg/L 和 100 μg/L TGF－β1组比 1 μg/L TGF－β1组对 ASMCs增殖作用明显增加(P ＜0.01)，10 μg/L TGF－β1组和 100 μg/L TGF－β1组相比，ASMCs增殖细胞占细胞总数的百分比无明显变化，两种浓度增殖作用无有明显差别(P＞0.05)。而2周和6周哮喘组相比，加入不同浓度 TGF－β1干预后的差别不大(P＞0.05)。结论与正常鼠相比，2周和6周哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖明显，处于 S期的细胞比例明显增高，6周哮喘大鼠气道平滑肌较2周哮喘大鼠增殖更明显。经TGF－β1干预后，2周和6周哮喘哮喘大鼠气道平滑肌细胞处于 S期的细胞比例增加，增殖增强，提示TGF－β1可能在哮喘早期阶段即可促进大鼠气道平滑肌细胞增殖，并促进各阶段哮喘大鼠气道平滑肌细胞持续增殖。

转化生长因子－β1;气道平滑肌细胞;增殖

哮喘被认为是一种气道慢性非特异性炎症性疾病，许多细胞因子和炎症介质参与了这个病理生理过程。转化生长因子－β1(transforming growth factor，TGF－β1)作为一种多功能的调节细胞生长、分化的细胞因子，在哮喘中可由多种活化的细胞产生，被认为具有促纤维化和抗炎等作用［1］。研究发现 TGF－β1是一种多向性细胞因子，在哮喘患者气道组织中表达增高，参与哮喘气道炎症反应和免疫应答，并且通过刺激气道平滑肌细胞增生、肥大，诱导气道成纤维细胞向成肌纤维细胞转化，促进细胞外基质蛋白合成和上皮下纤维化形成，是引起哮喘气道重构的重要细胞因子［2］。体外研究也表明:转化生长因子－β(TGF－β)可促进正常及哮喘气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖［3］。而转化生长因子－β1(TGF－β1)对哮喘急性期ASMCs增殖及慢性哮喘ASMC增殖的调节作用尚不十分清楚。

本实验通过制备大鼠哮喘急性期模型及慢性哮喘模型，培养大鼠叶支气管 ASMCs，用不同浓度的TGF－β1干预细胞生长，观察ASMCs的增殖，探讨TGF－β1在哮喘平滑肌细胞增殖中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

胎牛血清(杭州四季青生物所);小鼠抗α平滑肌肌动蛋白(α－actin)单克隆抗体(博士德公司);DMEM 培养基(Gibco公司);卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)、I型胶原酶(collagenase)(美国Sigma公司);转化生长因子－β1(TGF－β1)购自武汉博士德公司;PCR引物、内参照三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物由上海生工生物工程公司合成，余为进口或国产试剂，分析纯。

1.2 方法

1.2.1 大鼠哮喘模型的建立:15只健康雄性Wistar大鼠(合格证号:山医字第 070101)分为三组，体重200～250 g，由山西医科大学实验动物中心提供。适应性喂养1周后，第1天大鼠腹腔注射含100 mg OVA和200 mg氢氧化铝的生理盐水1mL，同时腹腔注射百日咳杆菌疫苗1mL(约6×109个菌株)作为佐剂，第8天重复致敏1次，第15天开始激发，将大鼠置于特制玻璃容器内，用超声雾化器喷入 2%OVA生理盐水 50mL，激发 30 min，每天1次，一组激发2周(哮喘早期阶段)，另一组激发6周(慢性哮喘模型)。激发后大鼠出现烦躁、呛咳、呼吸加快及轻度紫绀等哮喘发作症状即为模型制作成功。正常大鼠以等量生理盐水代替 OVA注射，并吸入生理盐水50mL 2周。

1.2.2 ASMCs的分离、培养及鉴定:参照 Johnson等［4］的培养方法，上述大鼠腹腔注射 25% 乌拉坦(4mL/kg)麻醉后，开胸迅速取出肺脏置于预先冰浴的D－hanks＇溶液，在解剖显微镜下仔细分离出叶支气管，并将支气管外膜剥离干净，刮除内皮，将获得的单层ASM在小烧杯中剪成1mm×1mm的小块后，加入1 g/LⅠ型胶原酶，37℃，5%CO2培养箱中消化1 h后加入 DMEM液，混匀后用200目金属滤网过滤，滤液置离心管内1000 r/min离心5 min。弃上清后，沉淀的细胞用含20%FBS、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL的 DMEM 培养液重悬，接种到培养瓶内，让细胞贴壁生长。原代培养的细胞生长约7～10 d后融合。0.25% 胰蛋白酶消化传代，用含10%FBS、青霉素 100 U/mL、链霉素 100 U/mL的DMEM培养液传代培养，每2～3天换液1次，约3～4 d细胞长满后传代，3～7代的细胞用于实验。小鼠平滑肌 α－肌动蛋白(α－actin)免疫细胞化学染色鉴定为ASMCs。

1.2.3 实验分组:各组哮喘模型大鼠均取第3～7代培养的气道平滑肌细胞，0.25%胰蛋白酶消化，台盼蓝染色法计数，细胞存活率大于 96%。用含10%FBS的DMEM培养，待细胞90%融合后，换无血清DMEM培养24 h，使细胞生长同步于G0期，换用含10%FBS的 DMEM液，随机分为5组:(1)对照组:培养的正常大鼠气道平滑肌细胞，每孔/瓶中不加任何干预 ;(2)模型组:培养的哮喘大鼠气道平滑肌细胞，每孔/瓶中不加任何干预;(3)、(4)、(5)组分别为不同浓度的 TGF－β1干预组:培养的哮喘大鼠气道平滑肌细胞，每孔/瓶中分别加入终浓度为每孔 /瓶中分别加入终浓度为 1 μg/L、10 μg/L 及100 μg/L的 TGF－β1;各组加入试剂后放入 CO2培养箱中共培养24 h，进行下述实验，每 4个复孔/瓶为一组，实验重复3次。

1.2.4 细胞增殖检测

1.2.4.1 流式细胞仪分析 ASMCs细胞周期:各组ASMCs按106/mL的密度接种于100cm2的培养瓶，培养及分组如前述，收集的 ASMCs用 PBS液配制成浓度为 1×106个/mL的细胞悬液，用预冷的75% 乙醇固定，加入 RNA酶、碘化丙啶室温作用后，用 FACSort型流式细胞仪(美国 BD公司)Cellquest软件分析细胞周期中各期所占的百分比。

1.2.4.2 四甲基偶氮唑蓝(MTT)微量比色法测定ASMCs增殖:96孔板内的ASMCs培养结束时，每孔加 MTT(5 g/L)20 μL，培养 4 h后去培养液，加二甲基亚砜 150 μL振荡 30 min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪于490 nm处测定各孔 A值。

1.2.5 统计学方法:应用统计分析软件包SPSS13.0进行统计学分析。实验数据以均数±标准差表示。组间差异显著性检验采用方差分析，两两比较采用 q检验。

图3 流式细胞仪分析各组大鼠气道平滑肌细胞周期Fig.3 Analysis of cell cycle of ASMCs by flow cytometry

2 结果

2.1 细胞鉴定

在倒置显微镜下，经原代培养的 ASMCs呈梭形，有较长的突起，圆形的细胞核位于细胞中央，呈疏密相间、典型“峰和谷”生长状态(图1)。α－actin免疫细胞化学染色，免疫反应产物呈棕黄色。97%细胞 α－actin染色阳性，所培养的细胞为平滑肌细胞［5］(图2)(图1～2，见彩插 5)。

2.2 流式细胞仪分析 ASMCs细胞周期

与对照组 ASMCs比较，2周及 6周哮喘组ASMCs的G0/G1期细胞所占比例均明显减少(P＜0.01)，S期细胞所占比例均增高(P＜0.01)，表明处于有丝分裂期的细胞数目增多。加入不同浓度TGF－β1共培养 24 h后，各干预组 ASMCs的 S期细胞所占比例较哮喘组均明显增高(均P＜0.01)(表1和图3)。

2.3 MTT检测 ASMCs增殖

与对照组相比，2周和6周哮喘组 ASMCs A值显著增加(P＜0.01)，2周和6周哮喘组各个 TGF－β1干预组 ASMCs A值与各自哮喘组相比均显著增高(均 P＜0.01)(表2)。

表1 TGF－β1对哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响(n=3)Tab.1 TGF－β1effect on cell proliferation of ASMCs in asthmatic rats(n=3)

表2 TGF－β1对哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响(n=3)Tab.2 TGF－β1effect on cell proliferation of ASMCs in asthmatic rats(n=3)

3 讨论

支气管哮喘是以呼吸道高反应性和不可逆性呼吸道重塑为特点的呼吸道慢性炎性反应性疾病［6］。呼吸道重塑的病理表现为呼吸道上皮细胞的破坏脱落，黏液细胞(SMA)增生和肥大，基底膜增厚，平滑肌细胞增生肥大，血管增生，血管上皮细胞下和黏膜下层纤维化，呼吸道受到慢性炎性反应因子反复刺激引起了呼吸道重塑。其中气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖在气道重塑中占有十分重要的地位，增殖的 ASMCs使气道壁增厚，导致基础气道阻力增加和不可逆性气流受限的发生。ASMCs培养发现，多种炎症介质和炎性细胞产物均可作用于 ASMCs，在基因水平对 ASMCs的增殖进行调节。

近年来，有学者对转化生长因子－β1(TGF－β1)与哮喘呼吸道重塑的相关性进行了大量研究，认为TGF－β1是致呼吸道重塑的重要细胞因子［7］。研究发现在不同程度哮喘患者气道中 TGF－β1水平显著高于正常个体，高水平 TGF－β1参与了由于炎症导致气道损伤的气道修复过程，在正常环境下可促进组织修复、抑制炎症的发展。但是，如果气道受到反复抗原刺激引起持续的慢性炎症，就可导致TGF－β1持续过度增高，从而引起组织纤维化和气道重建及气道慢性阻塞［8］。本实验通过建立不同阶段的大鼠慢性哮喘模型，取气道平滑肌细胞进行原代培养，用不同浓度的 TGF－β1干预细胞生长。研究发现:与对照组 ASMCs相比，两周及六周哮喘组ASMCs的 G0/G1期细胞所占比例均明显减少，S期细胞所占比例增高，表明细胞内DNA合成明显增加，处于有丝分裂期的细胞数目增多。加入不同浓度TGF－β1干预后，与哮喘组相比，两周及六周哮喘的各干预组 ASMCs的 S期细胞所占比例都明显增加，即细胞内DNA合成增加，处于静止期和 DNA合成前期的细胞数目都减少。而且从实验中观察到随着TGF－β1干预浓度的增加，S期细胞所占比例逐渐增多。同时在两周组和六周组均观察到，10 μg/L TGF－β1组和 100 μg/L TGF－β1组比 1 μg/L TGF－β1组对ASMCs增殖作用明显增加，且差别均有统计学意义，但 10 μg/L TGF－β1组和 100 μg/L TGF－β1组相比，ASMCs增殖细胞占细胞总数的百分比无明显变化，两种浓度增殖作用无有明显差别。用 MTT法观察到:两哮喘组 ASMCs的A490值较对照组明显增高，细胞存活和生长能力明显增强，两哮喘组加入各浓度TGF－β1干预后显示 A490值较各哮喘组均增加，且差别均有统计学意义。但比较两组流式细胞分析及MTT的结果看，两周组和六周组相比，加入不同浓度 TGF－β1干预后的差别不大，无统计学意义。实验结果表明:TGF－β1可使不同阶段哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖增强，处于增殖期的细胞数目增多。提示TGF－β1对体外培养的哮喘气道平滑肌细胞早期就有促进增殖的作用。这一结果与TGF－β1在正常大鼠 ASMCs中的促增殖作用相同［9］。TGF－β1在两周哮喘组和六周哮喘组中均可促进气道平滑肌细胞增殖增强，显示 TGF－β1在哮喘发生的早期变应性炎症阶段即开始起作用［10］。在支气管和肺部局部高水平表达的TGF－β1可引起呼吸道重塑，而哮喘所激活的许多种细胞都能产生TGF－β1，TGF－β1促进气道平滑肌细胞和杯状细胞增生肥大，增加胶原和纤连蛋白合成，并促进其在细胞外基质沉积，从而产生导致管腔狭窄和不可逆的肺功能改变等一系列不良后果。阻断 TGF－β1的作用途径，有可能达到抑制气道重建的目的。目前临床上防治哮喘气道重塑尚无理想的方法，本课题为哮喘气道重塑的防治提供了一种新思路，本实验结果对于我们在哮喘发生的早期干预气道重建有一定的帮助。综上所述，TGF－β1对哮喘的气道重塑有重要的作用，抑制 TGF－β1在哮喘中的作用可能为哮喘的治疗提供一种可供选择的新方法。

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Effect of TGF-β1on Airway Smooth Muscle Cells Proliferation in Different Periods of Asthmatic Rats

LIN Peng－xiang1，ZHANG Huan－ping2，ZHANG Ai－zhi1
(1.ShanXi Medical University，Taiyuan 030001，China;2.Department of Respiration First Affiliate Hospital of ShanXi Medical University，Taiyuan 030001，China)

Objective To investigate the effect of TGF－β1on airway smooth muscle cells(ASMCs)proliferation in different periods of asthmatic rats.Methods The establishment of 2 week and 6 week rat model of asthma through ovalbumin(OVA)sensitization and excitation.Primary cultures of ASMCs were established for experiments.ASMCs were treated with 1 μg/L，10 μg/L and 100 μg/L TGF－β1.Proliferation of ASMCs was detected by flow cytometry and MTT colorimetric assay.Results The percentage of cells of at S phase and A value of 2 week and 6 week asthmatic ASMCs were(34.31±1.41)%，(35.96±3.46)%，(0.546±0.005)and(0.559±0.009)respectively，significantly increasedcompared with the control group〔(12.24±2.64)%，(0.289±0.009)respectively，(P ＜0.01)〕.The percentage of cells of at S phase and A value of 2 week and 6 week asthmatic ASMCs，which were cultured in different concentration of TGF－β1，were significantly higher than the asthmatic group(P ＜0.01).The percentage of cells of at S phase and A value of 10 μg/L and 100 μg/L TGF－β1group were significantly higher than 1 μg/L TGF－β1group(P ＜ 0.01);and there was no significant change in ASMCs proliferation compared 10 μg/L TGF－β1group with 100 μg/L TGF－β1group(P ＞ 0.05).There was no significant difference in the effect of TGF－β1on ASMCs proliferation between 2 week and 6 week asthmatic model group(P ＞ 0.05).Conclusion Compared with normal rats，the proliferation of ASMCs in different periods of asthmatic rats were obvious and that of 6 week asthmatic model group was more obvious，the percentage of cells at S phase was increasing.And ASMCs in different periods of asthmatic rats were intervened by TGF－β1，the percentage of cells at S phase was increased and the proliferation of ASMCs was enhanced，TGF－β1may contribute to the proliferation of ASMCs in the early stage of asthmatic rats，and significantly promote the proliferation of ASMCs in different periods of asthmatic rats.

Transforming growth factor β1(TGF－β1);Airway smooth muscle cells(ASMCs);Proliferation

R373

1671－7856(2010)07－0044－05

2010－03－05