开心散与去茯苓开心散改善拟AD动物学习记忆作用比较

高冰冰，徐淑萍，刘新民，王立为

(中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193)

开心散与去茯苓开心散改善拟AD动物学习记忆作用比较

高冰冰，徐淑萍，刘新民，王立为

(中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193)

目的 比较开心散和去茯苓开心散对AD动物模型学习记忆的改善作用，了解茯苓在开心散复方中的作用。方法 连续皮下注射D－半乳糖12周，第9周同时给予中药，第12周开始行为学检测。比较开心散及去茯苓开心散对拟AD动物学习记忆的改善作用;检测脑组织皮层区乙酰胆碱酯酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)的活力以及丙二醛(MDA)的含量。结果 开心散能显著改善模型动物学习记忆能力;降低模型动物脑组织皮层区乙酰胆碱酯酶活力，升高超氧化物歧化酶活力，降低丙二醛含量;而去除茯苓的开心散对模型动物的学习记忆能力没有改善作用或作用减弱。结论 开心散复方具有改善拟AD动物模型学习记忆障碍的作用，而茯苓是开心散复方中起重要作用的成分。

拟老年性痴呆模型;D－半乳糖+东莨菪碱模型;昆明小鼠;开心散;茯苓

阿尔茨海默病(Alzheimer＇s disease，AD)已成为严重威胁人类健康、影响社会发展和稳定的重要因素。随着老龄化社会的到来，AD的发病率逐年升高，老年性疾病已成为社会关注和相关学科研究的热点。目前 AD仍缺乏有效的治疗药物，寻找有效的AD治疗药物是当前神经药理学研究的热点领域之一。

开心散始载于《备急千金药方》，由人参、远志、茯苓、菖蒲4味药材组成，主治“心气不定，五脏不足，甚者忧愁悲伤不乐，忽忽喜忘，朝差暮剧，暮差朝发狂眩”。其中，人参用于大补元气、健脑益智;茯苓用于养心安神、健脾利湿;远志、菖蒲用于化痰开窍、健脑醒神［1］。经过古人长期的临床实践，开心散具有良好的益智作用。现代药理研究表明，开心散能够改善不同拟AD模型动物的学习记忆能力，显示了在促智方面良好的应用前景［2－5］。本实验旨在通过比较开心散以及去除茯苓的开心散改善拟AD动物学习记忆作用的不同，来说明茯苓在开心散复方中发挥的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级KM雄性小鼠90只，28～30 g，购自中国医学科学院实验动物中心［SCXK(京)2009－0007］，于本所 SPF动物房中饲养，实验室温度 22℃～25℃，明暗周期 12 h/12 h。

1.2 实验用药及试剂

人参、远志、石菖蒲、茯苓水煎剂均由本所药植化室潘瑞乐老师提供;D－半乳糖(D－galactose，D－gal)为Sigma公司产品;东莨菪碱(Scopolamine，Scop)购于 Fluka公司，生产批号:2040506;AchE、SOD、MDA测试试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，生产批号:20091224。

1.3 主要仪器

跳台以及小鼠圆形水迷宫计算机图像实时检测分析处理系统均由中国医学科学院药用植物研究所、中国航天员科研训练中心、北京三维拓盟数字影像技术有限公司联合研制。

1.4 动物分组及给药剂量

将90只KM雄性小鼠随机分为6组，分别为正常对照组、D－gal+Scop模型组、开心散高剂量组(KXSG:10 g/kg)、开心散低剂量组(KXSD:5 g/kg)、去茯苓开心散高剂量组(QFLKXSG:7 g/kg)、去茯苓开心散低剂量组(QFLKXSD:3.5 g/kg)，15只/组。

1.5 AD动物模型的建立

除正常对照组皮下注射生理盐水外，其他各组连续皮下注射 D－gal(150 mg/kg)12 周［6－11］，第 9 周皮下注射D－gal的同时灌胃给予中药，第12周开始行为学测试，每天测试前30 min腹腔注射Scop(3.0 mg/kg)［12，13］。

1.6 行为学检测

1.6.1 Morris水迷宫测试［14－16］:给药第 12 周，开始Morris水迷宫测试，以测定动物的空间学习记忆能力，迷宫水温控制在25℃ ±1℃，水池外有固定参照物如门、窗、挂件等，每次试验位置保持不变。测试分为两个阶段，首先是定位航行试验:试验前30 min腹腔注射Scop，训练开始时，将实台置于固定象限(第四象限)，然后将动物置于平台上适应环境20 s，之后分别从第一和第二两个象限将动物面向池壁放入水池，计算机图像实时检测分析处理系统自动记录动物在60 s内找到平台的时间(逃避潜伏期)，如果动物在60 s内找不到平台，则将其引导至平台上适应10 s，潜伏期记录为60 s，再进行下次实验。每天训练2次，共训练7 d，计算每天每组动物中找到平台的小鼠所占百分比即游出率。第8天进行空间探索试验:在撤除平台后，从第一象限将动物面向池壁放入水中，计算机图像实时检测分析处理系统记录动物60 s内在原实台象限的游程比(在第四象限的游程/总游程)和时间比(在第四象限的游泳时间/总时间)。

1.6.2 跳台测试:Morris水迷宫测试结束后，动物休息两天进行跳台测试［17，18］。测试分为两个阶段，即记忆获得和记忆巩固。记忆获得:先将动物轻放入箱内熟悉环境2 min，测试开始时，将动物置于铜网上，开始通电，记录动物受到电刺激后第一次逃避到台上的潜伏期、5 min内停留在台上的时间(安全区时间)、受电刺激的时间(错误区时间)，以此作为学习成绩。24 h后进行记忆巩固测试:将动物置于安全平台上，即刻通电，检测5 min，记录动物第一次跳下平台的时间(潜伏期)、安全区时间、错误区时间，以此作为记忆成绩。

1.7 脑组织生化指标的检测

跳台检测完毕后，将动物断头处死，在4℃冰袋上立即将动物脑组织取出，在预冷的生理盐水中漂洗，除去血液，分离出皮层，称重后制成10%的组织匀浆液，并用冷冻离心机在 4℃条件下以3000 r/min，离心10 min，取上清置 2mL带盖离心管中于－80℃保存，试剂盒检测 AchE、SOD活力及MDA 含量［3，19，20］。

1.8 统计学方法

使用SPSS13.0统计软件进行分析，实验结果以均数±标准误表示。采用两样本t检验和非参数检验(Mann－Whitney Test)进行两两比较，采用单因素方差分析(ANOVA)进行多组间比较，组间差异采用LSD(方差齐)或者 Games－Howell法(方差不齐)。

2 结果

2.1 KXS和QFLKXS对拟AD小鼠空间学习记忆能力的影响

Morris水迷宫定位航行实验中，随着训练时间的延长，各组游出率逐渐升高，但 D－gal+Scop组游出率上升幅度明显小于正常对照组(P＜0.01)，D－gal+Scop组训练前5 d游出率不超过10%，第7天仅30%小鼠找到平台。第3天起KXSG组的游出率较 D－gal+Scop组明显升高(P＜0.01或 P＜0.05)，而 QFLKXSG和 QFLKXSD组则与 D－gal+Scop组相近，差异不显著(表1)。同时，D－gal+Scop组小鼠的逃避潜伏期较正常对照组显著延长(P＜0.01)，提示模型动物的空间位置学习记忆能力均明显下降。KXSG、KXSD组能不同程度提高D－gal+Scop小鼠的学习记忆能力，表现为潜伏期显著缩短(P＜0.05);而 QFLKXS组与 D－gal+Scop组比较差异不显著(表2)。空间探索实验中，D－gal+Scop组与正常对照组比较空间探索能力明显较弱(P＜0.01或 P＜0.05)，KXS有改善 D－gal+Scop小鼠的空间探索能力，但差异不显著(表3)。

表1 KXS和QFLKXS对D－gal+Scop导致的学习记忆障碍小鼠游出率的影响(n=15)Tab.1 Effect of KXS and QFLKXS on the percentage of finding the security desk of ammines mice induceded by D－gal+Scop(n=15)

表2 KXS和QFLKXS对D－gal+Scop导致的学习记忆障碍小鼠潜伏期的影响 (n=15)Tab.2 Effect of KXS and QFLKXS on the escape latency of ammines mice induced by D－gal plus scop(n=15)

表3 KXS和QFLKXS对D－gal+Scop导致的学习记忆障碍小鼠在目标象限游程比、时间比的影响 (n=15)Tab.3 Effect of KXS and QFLKXS on the ratio of swimming distance in target quadrant and total swimming distance，the ratio of swimming time in target quadrant and total swimming time of ammines mice induced by D－gal+scop(n=15)

2.2 跳台测试结果

记忆获得阶段，D－gal+Scop组较正常对照组潜伏期明显延长，安全区时间缩短，错误区时间延长，各指标均有极显著性差异(P＜0.01)，提示其被动逃避电刺激能力显著下降;KXSG、KXSD组以及QFLKXSG组均能不同程度提高模型小鼠学习记忆能力，表现为潜伏期缩短，安全区时间延长，错误区时间减少，差异极显著(P＜0.01);而QFLKXSD组则无此改善作用(表4)。记忆巩固测试结果显示，D－gal+Scop组的记忆保持能力较正常对照组下降，安全区时间缩短、错误区时间延长，给药组能够不同程度改善模型小鼠的学习记忆能力，但没有统计学差异。

表4 KXS和QFLKXS对D－gal+Scop导致的学习记忆障碍小鼠的记忆获得能力的影响 (n=15)Tab.4 Effect of KXS and QFLKXS on the memory acquisition of ammines mice induced by D－gal+Scop(n=15)

2.3 脑组织皮层生化指标测定结果

2.3.1 KXS与QFLKXS对模型小鼠大脑皮层AchE活力的影响(表5):D－gal+Scop组AchE活力比正常对照组显著升高(P＜0.01)，KXSG、KXSD组能够降低模型组小鼠大脑皮层AchE活力的升高(P＜0.01)，而QFLKXSG、QFLKXSD组的作用减弱(P＜0.05)。

2.3.2 KXS与QFLKXS对模型小鼠大脑皮层SOD活力、MDA含量的影响(表5):与正常对照组比较，D－gal+Scop组SOD活力下降、MDA含量升高，差异非常显著(P＜0.01);KXSG、KXSD组能显著升高SOD活力、降低 MDA含量(P＜0.01);相比之下，QFLKXSG、QFLKXSD发挥的这种作用则要明显降低(P＜0.01或 P＜0.05)。

表5 脑组织皮层AchE、SOD活力以及MDA含量检测结果 (n=15)Tab.5 The vitality of AchE and SOD;the level of MDA in cortex(n=15)

3 讨论

AD是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，早期主要表现为短时记忆损害、空间辨别能力等障碍。发病机制已提出的有:胆碱能假说、淀粉样蛋白假说、基因突变假说、炎症免疫假说等。基于这些假说研究者已建立起相应动物模型包括:药物损伤胆碱能神经系统，腹腔注射东莨菪碱可阻断乙酰胆碱M受体，引起记忆损失;应用造成代谢紊乱方法制作AD模型:D－半乳糖促使动物快速老化，在短时间内造成亚急性衰老动物模型;脑内注射 β－淀粉样蛋白;应用神经毒性兴奋性氨基酸造成AD动物模型等，但是以上单因素模型造成的损伤不能够造成动物的病理性损伤，因此很难模拟 AD 患者的临床特征［6，21］。本实验通过D－半乳糖+东莨菪碱建立AD复合模型，采用经典的 Morris水迷宫和跳台实验，对 KXS和QFLKXS改善AD小鼠空间学习记忆能力进行了评价。实验结果表明，D－gal+Scop复合模型能够有效地损伤正常动物的空间学习记忆能力，与正常小鼠比较，学习记忆能力减退，表现为Morris水迷宫逃避潜伏期延长，游出率上升缓慢;跳台实验中的逃避电刺激的潜伏期延长、记忆获得阶段第一次跳下平台的潜伏期缩短等。

中枢学习和记忆以及认知功能的正常发挥与中枢胆碱能系统有密切关系;SOD是体内天然的抗氧化物，能清除自由基而具有抗自由基损伤作用;MDA是氧化应激反应中脂质过氧化的产物，其含量的变化可间接反映AD病理状态下机体脂质过氧化水平的高低，反映组织细胞损伤的程度。大量文献报道，MDA含量随增龄而增高，而SOD的活性随增龄而降低。D－gal诱导的亚急性衰老模型，是基于衰老学说建立的，其在代谢过程中形成的过量超氧阴离子自由基的过氧化反应与人体衰老变化基本一致［22，23］。本实验结果显示，连续皮下注射 D－gal能够引起AchE活力升高，降低 SOD活力，升高 MDA含量，同时复合腹腔注射Scop能加重损伤效应，使脑组织皮层区AchE活力升高尤为明显。

KXS能够显著改善模型动物的学习记忆能力减退，Morris水迷宫结果显示，第三天起KXSG组的游出率较D－gal+scop组明显升高，而QFLKXS则与D－gal+Scop组相近，同时KXS能够缩短模型动物的逃避潜伏期，而QFLKXS则没能改善模型动物的学习记忆能力。跳台实验结果显示，KXS以及QFLKXSG组均能不同程度地提高模型小鼠的记忆获得能力，而QFLKXSD组无改善作用，说明在同等剂量的条件下QFLKXS改善模型动物学习记忆的能力下降。综上所述，提示茯苓在复方开心散改善拟AD动物学习记忆障碍中的重要作用。另外，KXS组能显著降低D－gal+Scop复合模型小鼠大脑皮层的AchE活力，升高SOD活力，降低MDA含量，在抗氧化方面有明显的作用，而QFLKXS组在同等剂量表现出来的改善模型小鼠学习记忆障碍的作用则减弱甚至没有作用，进一步证实茯苓在开心散改善拟AD动物学习记忆障碍作用中是不可缺少的重要组成部分，其作用机制可能与减低大脑皮层 AchE活力，升高SOD活力，降低MDA含量有关。

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Comparision of Nootropic Effects of Kaixinsan Prescription and Kaixinsan without Poria cocos(Schw.)Wolf to Alzheimer's Mice Model

GAO Bing－bing，XU Shu－ping，LIU Xin－min，WANG Li－wei
(Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College Institute of Medicinal Plant Development，Beijing 100193，China)

Objective To compare the improving effect of Kanxinsan(KXS)and KXS without Poria(QFLKXS)on learning and memory of amnesia mice，and to learn the role of Poria in KXS.Methods The animals were

subcutaneous injection of D－gal for 12 weeks，and were given medicine at the same time in the 9th week.The behavioral test was started in the 12th week.The effect of KXS and KXS without Poria on improving learning and memory of amnesia mice was compared and Acetylcholinesterase(AchE)，superoxide dismutase(SOD)activity，oxidation products malondialdehyde(MDA)content of brain were detected.Results KXS improved learning and memory capacity of AD mice significantly.Furthermore，we found that KXS reduced acetylcholinesterase activity and decreased malondialdehyde content in cortex，while increased superoxide dismutase activity significantly.In comparison，KXS without Poria had no effect or diminished effect.Conclusion KXS prescription can improve the learning and memory of animal models of Alzheimer＇s disease，and the Poria is essential for the necessary ingredients in KXS prescription.

Animal model of dementia;Model of D－galactose+Scopolamine;KM mouse;Kaixinsan;Poria cocos(Schw.)Wolf

R473.74

A

1671－7856(2010)07－0057－06

2010－04－09

科技部对欧盟科技合作专项(0815)和国家科技重大新药创制项目(2009ZX09502－017)。

高冰冰(1984－)，女，硕士生，研究方向:中药神经药理。E－mail:ice_happy5889@yahoo.cn

王立为(1951－)，男，研究员，硕士生导师。E－mail:wlw988@126.com