长春新碱对糖尿病兔肾小管间质损伤的影响

刘伟林，朱 昆

(长春解放军第208医院实验动物室，肾内科，长春 130062)

长春新碱对糖尿病兔肾小管间质损伤的影响

刘伟林，朱 昆

(长春解放军第208医院实验动物室，肾内科，长春 130062)

目的 观察长春新碱对糖尿病兔肾小管－间质损伤的影响。方法 24只日本大白兔随机分成正常对照组(control组)、糖尿病组(DM组)、糖尿病长春新碱治疗组(DV组);耳缘静脉注射四氧嘧啶造成糖尿病兔模型，DV组每周进行一次长春新碱耳缘静脉注射;胰岛素控制DM组、DV组血糖16.0～25.0mmol/L。8周时测各组兔血糖、肾重、体重、尿β2－MG、RBP、NAG，肾组织病理观察肾小管－间质变化。结果 给药后7 h DV组、DM组血糖明显升高形成稳定糖尿病模型;8周时，DV组体重明显高于DM组(P＜0.05)、肾重/体重值明显低于DM组(P＜0.05);DM组、DV组尿β2－MG阳性反应率较低;DM组尿RBP、NAG明显高于control组(P＜0.05)，长春新碱可抑制糖尿病兔尿RBP、NAG增加(P＜0.05)，并减轻糖尿病兔肾小管间质损伤指数(P＜0.05)。结论 长春新碱可减轻糖尿病兔肾小管间质损伤。

糖尿病;兔;炎症;长春新碱;肾小管－间质

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见的慢性并发症，进入临床阶段后病程进展很快，治疗方法有限。既往的研究多集中在肾小球上，对肾小管间质的研究甚少。本实验观察了糖尿病兔尿 β2－微球蛋白(β2－MG)、视黄醇结合蛋白(retinol－binding protein，RBP)、N－乙酰－β－D－氨基葡萄糖苷酶(N－Acetyl－β－D－Glucosaminidase，NAG)变化及肾小管间质病理损伤，初步探讨了长春新碱(vincristine，VCR)对这些变化的影响。

1 材料和方法

取24只雄性日本大白兔，空腹体重1.5～2.0 kg之间，随机分成对照组(control组)、糖尿病组(DM组)、糖尿病长春新碱治疗组(DV组)，三组之间体重、血糖无显著差异;禁食水8 h后，将四氧嘧啶(Sigma公司)用生理盐水配制成2.5%溶液，按0.1 g四氧嘧啶/kg于0.5 min内耳缘静脉注射入DM组、DV组兔体内，control组注射生理盐水，之后自由进食水。至72 h，DM组、DV组兔血糖大于16.0mmol/L，造模成功;每周两次给生物合成人胰岛素注射液(丹麦诺和诺德公司)皮下注射，剂量2～4 u/kg，控制血糖16.0～25.0mmol/L;对照组皮下注射生理盐水。

造模成功后，DV组予每周一次耳缘静脉注射长春新碱(上海华联制药有限公司)，剂量按成人每周1 mg/60kg由动物给药公式［1］换算;DM组和control组予生理盐水耳缘静脉注射。每周监测各组血糖、体重变化;血糖用美国FreeStyle血糖分析仪检测。

于第8周禁食水8 h后，称兔体重、测血糖，膀胱穿刺取尿液超低温保存，氯胺酮麻醉后取肾脏称重;计算肾重/体重值。

沿纵轴切开一侧肾脏，置于10%中性甲醛固定，石蜡包埋，2 μm切片行PAS染色。高倍镜(×400)下随机选择20个肾小管间质视野(无肾小球和血管)，应用病理图像分析系统软件(北京航空航天大学)测定肾小管间质面积。肾小管间质损伤评分标准如下:正常为0分;损伤面积＜25%为1分;损伤面积25%～50%为2分;损伤面积＞50%为3分。肾小管间质损伤指数(tubulointerstitial injury index，TII)为各视野积分平均值。

采用胶乳免疫比浊法检测尿?2－MG(试剂盒购自威特曼生物科技南京有限公司)、免疫透射比浊法检测RBP(试剂盒购自上海北加生化试剂有限公司)、速率法测定NAG(试剂盒购自威特曼生物科技南京有限公司)，均按试剂盒说明操作。

2 结果(图1～3，见彩插Ⅳ)

8周时各组指标变化(表1)。尿?2－MG在control组均呈阴性反应，DV组2只兔呈阳性反应(2只均为0.03 mg/L)、DM组3只兔呈阳性反应(分别为 0.05 mg/L、0.29 mg/L、0.15 mg/L)。DM组肾组织可见肾小管上皮细胞颗粒样变性、空泡变性，管腔内见蛋白管型，重者上皮细胞脱落，间质炎细胞浸润、纤维化(图1，2)，DV组肾小管间质损伤明显减轻(图3)，两组间TII比较差异显著(P＜0.05)。

表1 8周时各组指标比较Tab.1 Comparison of the data among three groups at 8th week

3 讨论

四氧嘧啶(alloxan)是一种β细胞毒剂，可选择性损伤兔胰岛细胞，引起化学性糖尿病。本实验中注射四氧嘧啶72 h后均导致兔持久性高血糖，体重增长缓慢，形成稳定的四氧嘧啶糖尿病模型。

典型的糖尿病肾病(DN)病理改变是肾小球基底膜增厚和系膜基质增生导致的肾小球硬化症，早期诊断可检测尿微量白蛋白。糖尿病肾病也存在肾小管间质损害，表现为肾小管上皮细胞肥大、颗粒样和空泡样变性，间质水肿，淋巴细胞、单核细胞浸润，甚至肾小管病变先于肾小球病变［2］，本实验观察到四氧嘧啶诱导的糖尿病兔同样存在上述肾小管间质损害。国内有报道［3，4］通过检测 β2－MG、NAG等小管间质损害指标可早期诊断糖尿病肾病。我们的实验观察到8周糖尿病兔尿β2－MG检出率较低，可能与β2－MG稳定性差、在酸性尿中易分解有关，可见尿β2－MG检测肾小管间质损害灵敏性较低。尿NAG与RBP反映近端小管受损灵敏性相近，前者主要来自近端小管上皮细胞溶酶体，反映近端小管结构的破坏，后者则反映近端小管重吸收功能减退，尚无观察糖尿病患者尿RBP的报道。本实验观察到8周时糖尿病兔尿NAG、RBP均明显高于正常对照组，进一步证实已出现肾小管结构和功能受损。糖尿病肾小管间质纤维化程度与系膜增生、肾小球滤过率下降及蛋白尿程度呈正相关，是决定糖尿病肾病预后的重要指标之一［5］。因此有必要将糖尿病肾小管间质损害列为治疗观察指标。

近期研究证实，高血糖、血液动力学异常、血管紧张素Ⅱ增加均可加剧肾脏炎症细胞浸润，释放炎症趋化因子(如MCP－1)，刺激细胞外基质分泌。已有学者证实抗炎治疗可延缓糖尿病肾病的进展。Fujihara等［6］证实霉酚酸酯可延缓STZ致实验性糖尿病大鼠出现高血压、蛋白尿、肾小球高滤过和肾小球硬化。ACEI及ART1拮抗剂治疗糖尿病肾病有效，部分是通过抗炎作用实现的［7］。我们的实验观察到长春新碱对四氧嘧啶致实验性糖尿病兔发挥了作用，体重增长较未治疗组明显，而尿NAG、RBP均明显低于未治疗组，肾脏病理显示肾小管间质损害明显减轻。长春新碱为细胞毒类药物，我们推测其具有抑制肾间质淋巴细胞和单核/巨噬细胞增殖、限制炎症趋化因子表达等抗炎作用，从而减轻肾小管结构和功能受损。已证实肾病患者慢性炎症状态是营养不良的重要原因，本研究DV组兔体重明显高于DM组，可能与长春新碱抗炎作用有关。

此外，糖尿病肾病存在细胞周期异常。肾小管上皮细胞和系膜细胞完成有限增生后发生肥大［8，9］，小管间质成纤维细胞及肾小球内皮细胞则持续增生［10，11］，增生肥大的细胞分泌更多的细胞外基质蛋白，导致肾脏体积增大。长春新碱作为细胞周期特异性药物，主要作用于M期，抑制细胞增生。本实验中长春新碱治疗组肾重/体重值明显低于未治疗的糖尿病兔肾重/体重值，可能与长春新碱抑制肾脏细胞增生有关。

长春新碱还可以改善血小板功能，抑制血小板凝集，缓解肾病的高凝状态［12］，间接发挥抗炎、抗增生作用。

本实验观察到长春新碱可降低糖尿病兔肾重/体重值、尿NAG、RBP，减轻糖尿病兔肾小管间质损害，其治疗机制有待通过免疫组化、分子生物学等方法进一步研究。

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Impact of Vincristine on Tubulointerstitial Injury of the Rabbit Model with Diabetes Mellitus

LIU Wei－lin，ZHU Kun
(The 208 Hospital of People Liberation Army，Changchun 130062，China)

Objective To investigate the impact of vincristine by tubulointerstitial injury to the rabbit model with diabetes mellitus.Method Male Japanese white rabbits were divided into three groups:control group，diabetes mellitus group(DM group)，diabetes mellitus treated with vincristine group(DV group).Alloxan was intravenously injected to make rabbit model with diabetes mellitus.Rabbits of DV group were intravenous－injected with vincristine.Blood glucouse of DM group and DV group fluctuates between 16.0～25.0mmol/L via insulin treatment.At the end of 8 weeks all rabbits were killed to determine blood glucouse value(BG)，kidney weight/body weight ratio(KW/BW)，urineβ2－microglobulin(β2－MG)，retinol－binding protein(RBP)，N－Acetyl－β－D－Glucosaminidase(NAG)concentration，tubulointerstitial injury were observed by light microscopy.Results After 72 hours of injecting vincristine，the models of DM group were established.At the end of 8 weeks，body weight in DV group was higher than that of DM group(P ＜0.05)，but KW/BW was lower than that of DM group(P ＜0.05).RBP，NAG concentration in DV group were significantly lower than that of DM group(P ＜0.05).Increased tubulointerstitial injury index in DM rabbits was lowered by vincristine(P＜0.05).Conclusion Vincristine could alleviate tubulointerstitial injury of the rabbit model with diabetes mellitus.

Diabetes mellitus;Rabbit;Inflammation;Vincristine;Tubulointerstitial

R587.1

A

1671－7856(2010)10－0052－03

10.3969/j.issn.1671.7856.2010.10.014

2010－06－22

图1 对照组
Fig.1 Control group

图2 DM组
Fig.2 DM group

图3 DV组
Fig.3 DV group

朱昆。E－mail:zhoogoo@sina.com