长春新碱对人成骨肉瘤MG63细胞的增殖抑制和凋亡促进作用及其机制

刘国雄，娄 楠，王 洋，吴元成，黄岚峰

（1.深圳市龙华新区人民医院，广东 深圳518109；2.深圳市人民医院；3.吉林大学第二医院）

骨肉瘤为青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤，恶性程度高，进展快，预后差，增加了临床治疗的难度。对骨肉瘤化疗药物的研究，近年来取得了一定的进展［1－2］，但仍有相当数量的患者对药物不够敏感或用后很快产生耐药性，预后不佳，而与此同时，现今所用的骨肉瘤相关药物均有很强的副作用，这就使大剂量的药物治疗变得难以接受。于是目前迫切需要寻求疗效更好的、副作用又小的化学治疗药物。长春新碱在应用于一些恶性肿瘤的治疗，如白血病等，均取得了很好的疗效［3］，但在长期应用于骨肉瘤这类恶性肿瘤方面，还鲜见系统的报道。本文应用骨肉瘤MG63细胞作为体外培养的实验模型，较为系统地研究了长春新碱对细胞抑制增殖及促凋亡的效应；分析了长春新碱对细胞内caspase 9及c－myc基因表达的影响，阐明其作用的分子机理，为指导治疗骨肉瘤这类恶性肿瘤的临床治疗，提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 MG63细胞来源于ATCC。Hoechest 33342及CCK－8细胞活性检测试剂盒源自碧云天生物技术研究所，Total RNA提取试剂源自Invitrogen公司，RNase free DNase I源自Promega，RT试剂盒源自TaKaRa，PCR引物由TaKa－Ra合成，实时PCR试剂（Sybe－Green）购自ABI公司，长春新碱源自哈尔滨医大药业有限公司。

1.2 细胞培养和长春新碱处理 细胞培养于10%胎牛血清的H－DMEM培养基中，在5%CO2、饱和湿度、37℃条件下于恒温孵育箱中进行培养。将处于指数增长期的细胞接种于培养皿中培养24h，而后分别加入配制好的不同浓度的长春新碱（0、5、10、20、50、100μg·L－1），继续培养24h后，开始收集细胞，进行检测。

1.3 细胞生长曲线测定 取指数生长期细胞，0.25%胰蛋白酶消化计数后接种96孔培养板，每孔接种100μl细胞悬液（1×103个细胞／孔），按照实验分组分别进行标记，每组设6个平行孔。37℃，5%CO2条件下培养，24h取出96孔板，在待测孔中加入10μl的CCK－8试剂，37℃孵育2h，测定490nm处吸光度，依据结果并绘制细胞生长曲线。

1.4 细胞形态观察 收集细胞于EP管中，用4℃预冷的PBS缓冲液清洗3次，将2mol·L－1的Hoechest33342分别加入经不同浓度长春新碱处理过的细胞，于37℃孵育30min，再用PBS缓冲液清洗3次，于荧光显微镜下观察。

1.5 Realtime RT－PCR检测基因表达水平 应用Trizol Reagent提取不同浓度长春新碱处理过的细胞总RNA，用RNase free DNase I处理相应的RNA，并用RT试剂盒将相应的RNA逆转录成为cDNA，以上操作均参考相关商品说明书。PCR引物序列：内参 RPL－13上游引物，5’－CGA GTT GGC TGG AAG TAC C－3’；下游引物，CTT CTG GCC TGT TTC CGT AG－3’。caspase9上游引物，5’－GCG ACC TGA CTG CCA AGA AA－3’；下游引物，5’－TCA CAA TCT TCT CGA CCG TTA CA－3’。c－myc上游引物，5’－ACA ACC GAA AAT GCA CCA GC－3’；下游引物，5’－GTC GTT TCC GCA ACA AGT CC－3’。应用Sybe－Green反应体系进行PCR反应；反应体积为25μl。PCR反应程序为：50℃、2min；95℃、10min；95℃、15s，60℃、1min；95℃、15s，60 ℃、30s，95℃、15s，40个循环。PCR反应产物的特异性均经其融解曲线证实。通过实验得到的各浓度实验组的Ct值，与各浓度内参RPL－13的Ct值进行比较，两者的差值即为该实验组的△Ct值，即实验组△Ct值＝实验加药组Ct值－内参加药组Ct值。同理对照组△Ct值＝实验对照组Ct值－内参对照组Ct值。通过实验组△Ct值与对照组△Ct值的比较，得出实验组各浓度的△△Ct值＝实验组△Ct值－对照组△Ct值。最后通过2（－△△Ct）来定量基因表达的改变。

1.6 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件，结果以±s表示，组间比较采用t检验法进行统计。

2 结果

2.1 长春新碱减低MG63细胞的增殖率 长春新碱浓度为1、2、5、10、20、50和100μg·L－1作用于MG63细胞24h后对细胞的影响。其中长春新碱浓度为10μg·L－1时即可显著抑制MG63的细胞增殖（P＜0.05），呈明确的剂量－效应关系，即抑制作用随着药物剂量的增加更明显。

图1 长春新碱减低MG63细胞的增殖率

2.2 长春新碱促进MG63的细胞凋亡 为反映长春新碱对细胞凋亡的作用，我们用Hoechest33342染色不同浓度处理过的MG63细胞，对照组细胞核呈均匀的淡蓝色，存活细胞占绝大多数，而凋亡细胞数量极少；在长春新碱作用下，出现一些散在分布的致密浓染物质，这些物质颜色发亮而体积较小，此为蓄积大量Hoechest染料的已经出现凋亡核浓缩现象的MG63细胞（如图2所示）。

2.3 长春新碱作用影响相关基因的表达 经过10和50μg·L－1长春新碱处理后，细胞内c－myc的mRNA表达量显著下调（P＜0.05），分别减低为对照组的（48.11±15.12）%和（35.84±5.97）%，呈明显的浓度依赖关系；caspase9mRNA表达量显著上调（P＜0.05），分别为对照组的3.46±1.24倍和16.85±2.02倍，呈明显的浓度依赖关系。表明长春新碱是通过下调c－myc基因表达，上调caspase9基因表达抑制MG63细胞增殖和促进凋亡的。

图2 长春新碱作用后凋亡细胞的形态学改变（×100）

图3 长春新碱显著下调细胞内c－myc及显著上调caspase9的mRNA表达水平

3 讨论

长春新碱是作用于细胞周期的一种特异性药物。通常在细胞周期的S期，同微管蛋白进行结合，进而干扰了纺锤体的生成，阻断了细胞周期进程，从而抑制肿瘤细胞增殖。长春新碱在其它方面也有显著的作用，例如它还可以影响细胞核酸或蛋白质代谢功能，进而抑制细胞增殖，诱导多种恶性肿瘤细胞发生凋亡［5－9］。

本研究深入讨论了长春新碱作用于骨肉瘤MG63细胞，进而产生的一系列抑制增殖及促进凋亡的作用，及其相关的分子机理。结果证实低剂量（10μg·L－1）的长春新碱即可显著抑制该细胞的增殖并促进其发生凋亡。该剂量远低于长春新碱可以引发的机体中毒剂量（2mg·kg－1），这也就提示我们，长春新碱作为治疗骨肉瘤这一类恶性肿瘤的新型化疗药物，具有广阔研究和应用的价值。有研究［10－11］显示：长春新碱当与其他药物联合应用时可增加MG63细胞对其他化疗药物的敏感性等，这些研究结果都可以支持本研究得出的结论。目前临床治疗骨肉瘤常用的化疗药物有单独或联合应用氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、顺铂（CDP）、异环磷酰胺（IFO）等一些药物。但也有相关研究［12－13］显示，这些药物长期大剂量应用对于心脏、肝、肾等重要器官有较强的毒副作用，并且应用这些药物化疗后多会出现多药耐药的病例。

细胞增殖是指细胞以分裂的方式产生新的个体或新的细胞，用来对抗衰老和死亡细胞的过程。机体细胞的正常增殖是按照需要被严格调控的。一旦细胞增殖失去调控则会引起相应的肿瘤发生。细胞增殖受到各种分子信号调控，其中c－myc是一种可使细胞无限增殖的基因，与多种肿瘤发生发展有关［13－15］。本研究结果显示：浓度为10μg·L－1长春新碱作用下就可以显著抑制MG63的细胞增殖（P＜0.05），并且呈明确的剂量－效应关系，即抑制作用随着药物剂量的增加更明显；且在10和50μg·L－1长春新碱作用下，MG63细胞内c－myc mRNA表达量显著减少（P＜0.05），分别为对照组的（48.11±15.12）%和（35.84±5.97）%，呈明显的浓度依赖关系。表明：长春新碱可以有效下调MG63细胞内c－myc mRNA表达量，是其致细胞抑制的主要原因。而c－myc可以导致多种肿瘤的发生，长春新碱可显著下调其mRNA表达水平，提示长春新碱的抗肿瘤机制之一是通过抑制细胞内c－myc的表达的途径来完成的。

细胞凋亡是机体为调控自身的生长发育，维护其内部环境的稳定，由自身基因控制的细胞主动死亡过程。细胞凋亡是化疗药物杀伤肿瘤细胞的重要机制。细胞凋亡可以发生细胞核的浓缩、染色体DNA被以核小体为单位而片段化，核固缩，以致最终形成凋亡小体，但并不释放溶酶体，引起周围细胞发生溶解。Caspase9在促进细胞凋亡的过程中起到了重要作用［16］。本研究的结果还显示：在长春新碱作用下，出现一些散在分布的致密浓染物质，这些物质颜色发亮而体积较小，此为蓄积大量Hoechest染料的已经出现凋亡核浓缩现象的MG63细胞；caspase9mRNA表达量显著上调（P＜0.05），分别为对照组的3.46±1.24倍和16.85±2.02倍，呈明显的浓度依赖关系。所以，长春新碱可以有效上调MG63细胞内caspase9mRNA表达量，是其促进细胞凋亡的主要原因。鉴于caspase9的促细胞凋亡作用，长春新碱可显著上调其mRNA表达水平，提示长春新碱的抗肿瘤的另一作用机制是上调细胞内caspase9的表达。

综上所述，长春新碱从较低浓度（10μg·L－1）开始就能抑制骨肉瘤MG63细胞增殖，且远低于其引起机体中毒剂量，这些都提示长春新碱作为治疗骨肉瘤这类恶性肿瘤的化疗药物具有较高的研究和应用价值；而其抑制细胞增殖的作用机制是通过下调c－myc mRNA表达水平，也是长春新碱的抗肿瘤作用机制之一。在较低浓度（10μg·L－1）长春新碱作用下即可引起细胞内出现明显的凋亡细胞；而其引起细胞凋亡的作用机制是通过上调细胞内caspase9mRNA表达水平，这也是长春新碱的抗肿瘤作用的另一机制。

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