猴B病毒囊膜蛋白gB特异性抗原表位的筛选与表达鉴定

张小飞，叶华虎，赵彦斌，王冬平，赵洪卫，白杰英

(军事医学科学院实验动物中心，北京 100071)

猴B病毒囊膜蛋白gB特异性抗原表位的筛选与表达鉴定

张小飞，叶华虎，赵彦斌，王冬平，赵洪卫，白杰英

(军事医学科学院实验动物中心，北京 100071)

目的 筛选和鉴定猴B病毒囊膜蛋白gB的特异性抗原表位，将其应用于B病毒的检测。方法 利用蛋白序列比较和表位预测技术筛选猴B病毒囊膜蛋白gB的特异性抗原表位，经PCR扩增后原核表达，纯化，Western-blot鉴定融合蛋白，建立特异性表位的ELISA检测方法，并对其效果进行评估。结果 琼脂糖凝胶电泳和测序结果显示出目的表位基因完全正确，并且重组蛋白经过SDS-PAGE、Western-blot鉴定，其相对分子质量约为27×103，与预期值相符。筛选出的gB-26肽表位检测结果与文献相符，特异性较好，敏感性稍低。结论 建立了猴B病毒囊膜蛋白gB特异性抗原表位筛选和鉴定的实验方法，为进一步研制猴B病毒快速诊断试剂盒和猴B病毒亚单位疫苗奠定了基础。

B病毒;囊膜蛋白gB;抗原表位;筛选;表达

猴B病毒属于疱疹病毒科，主要存在于亚洲尤其是印度系猕猴属(恒河猴、食蟹猴、豚尾猴等)动物中［1］。B病毒属于生物安全4级病原，既是潜在的生物战剂，又是影响实验猕猴质量及出口的主要疾病，还是猕猴从业人员以及实验科技人员安全健康的重要威胁。猴是B病毒的自然宿主，感染率可达10%～60%，多数情况下呈良性经过，仅在口腔黏膜和生殖器黏膜出现疱疹和溃疡，之后病毒可长期潜伏在三叉神经节和腰骶神经节［2］。人类感染主要表现为脑脊髓炎症状，多数病人死亡。

当前，诊断B病毒感染主要依赖于以全病毒作为抗原的血清学方法，但是，由于B病毒与人单纯性疱疹病毒(herpes simple virus，HSV)、猴因子8(simian agent 8 virus，SA8)［3］和狒狒疱疹病毒 4(herpes virus papio 2，HVP-2)具有高度的同源性。以全病毒作检测抗原，采用快速检测方法(ELISA、IEA和Dot blot杂交等)［4］，较强的交叉反应难以保证准确性。同源病毒，如HSV-1(国内目前使用的抗原)、HSV-2、SA8和HVP-2等，虽不存在严重安全隐忧，但假阳性和假阴性已使我国实验动物业界蒙受了巨大损失。较强的交叉反应难以保证准确性，因而特异性检测抗原是当前困扰B病毒快速诊断和有效防治的主要“瓶颈”，无论是B病毒的准确诊断还是有效防治，有效抗原的获得都是其中的关键环节。

本研究利用蛋白序列比较和表位预测技术筛选B病毒囊膜蛋白gB的特异性抗原表位，经PCR扩增后在大肠杆菌中进行原核表达，表位融合蛋白经Ni柱纯化和Western-blot鉴定。然后建立该表位的ELISA检测方法，并对其检测效果进行评估，为进一步研制B病毒快速诊断试剂盒和B病毒亚单位疫苗奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 相关软件

DNAMAN生物学分析软件、DNASTAR生物学分析软件。

1.2 相关网站

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，http://www.cbs.dtu.dk/，http://www.immuneepitope.org/。

1.3 质粒和菌种

质粒pET32-gB为研究室保存。E.coli DH5α、BL21(DE3)为研究室保存。

1.4 试剂和酶

质粒提取试剂盒购自TIANGEN(天根)生物技术有限公司，胶回收试剂盒购自WATSON(华舜)生物技术有限公司。耐热性DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶均是TaKaRa(大连宝生物)工程有限公司的产品。

1.5 仪器和器材

96孔ImmobilizerTM-氨基酶标板(Nunc)购自华美生物技术有限公司。PCR仪(BIO-RAD公司)、水平电泳槽(BIO-RAD公司)、立式电泳槽(BIO-RAD公司)、UVP凝胶成像系统、恒温摇床(37℃)、培养箱(37℃)、冰箱(4℃、16℃、－20℃、－70℃)、水浴锅、超净工作台等。

1.6 表位合成

BVgD蛋白C端9个氨基酸的多肽GPARRGAPY由上海生工合成，作为阳性对照。BV-gB筛选26个氨基酸的多肽由上海生工合成。

1.7 方法

1.7.1 表位筛选

1.7.1.1 查找猴B病毒囊膜蛋白gB、HSV-1、HSV-2的氨基酸序列:登陆国家生物技术信息中心NCBI(National Center for Biotechnology Information)，查找B virus gB、HSV-1、HSV-2、SA8、HVP-2 等病毒蛋白的氨基酸序列。

1.7.1.2 预测猴B病毒囊膜蛋白gB的信号肽序列:登陆生物序列分析中心 CBS(Center for Biological Sequence Analysis)，分析猴B病毒囊膜蛋白gB的氨基酸序列，预测其信号肽序列的位置。首先，登陆 http://www.cbs.dtu.dk/网站的主页。然后，打开CBS predication services并且选择SignalP从而运行SignalP 3.0 Server程序。最后，输入猴B病毒囊膜蛋白gB的氨基酸序列后点击运行即可。

1.7.1.3 预测猴B病毒囊膜蛋白gB的胞外区:登陆生物序列分析中心CBS(Center for Biological Sequence Analysis)，分析猴B病毒囊膜蛋白gB的氨基酸序列，预测其胞外区、跨膜区、胞内区的位置。首先，登陆http://www.cbs.dtu.dk/网站的主页。然后，打开CBS predication services并且选择TMHMM从而运行TMHMM Server v.2.0程序。最后，输入猴B病毒囊膜蛋白gB的氨基酸序列后点击运行即可。

1.7.1.4 比较猴B病毒囊膜蛋白gB与HSV-1、HSV-2的特异性:利用DNAMAN生物学分析软件(也可利用DNASTAR生物学分析软件)，比较猴B病毒囊膜蛋白 gB与 HSV-1、HCV-2、SA8、HVP-2等的氨基酸同源性。首先，打开DNAMAN生物学分析软件。然后，运行多重序列比较程序。最后，输入所要对比的氨基酸序列(如比较猴B病毒囊膜蛋白gB与HSV-1、HCV-2)，点击运行即可得出氨基酸序列间的相同序列及不相同序列。

1.7.1.5 预测猴B病毒囊膜蛋白gB的抗原表位:登陆抗原表位数据库和分析资源站IEDB(Immune Epitope Database and Analysis Resource)的网站http://www.immuneepitope.org/，利 用 Epitope Prediction and Analysis Tools对猴B病毒囊膜蛋白gB的氨基酸序列进行抗原表位的预测。也可以利用生物序列分析中心CBS的BepiPred 1.0 Server程序或者DNASTAR软件中的Protean Program来完成抗原表位的预测。

1.7.1.6 筛选猴B病毒囊膜蛋白gB的特异性抗原表位:基于以上氨基酸序列信号肽、跨膜区的分析结果，同源性的比较结果以及抗原表位的预测结果，从而筛选出猴B病毒囊膜蛋白gB的特异性抗原表位。符合实验要求的猴B病毒囊膜蛋白gB的特异性抗原表位应满足以下条件:筛选出的氨基酸序列应该尽量避开信号肽区域、跨膜区以及胞内区，并且是不具有同源性的序列，当然更为重要的是经抗原表位预测显示其具有抗原表位。

1.7.2 表位鉴定

1.7.2.1 gB上筛选表位的原核表达:分别根据目的表位序列设计引物，以阳性质粒pET32-gB为模板扩增多个表位序列，经酶切、连接、转化后送至英骏生物公司测序，结果正确后将其插入表达载体pET32b(+)，在 BL21(DE3)内原核表达，SDSPAGE检测蛋白表达水平。

1.7.2.2 Ni柱纯化:将以包涵体形式表达的菌体蛋白收集后超生破碎，离心后取菌体沉淀用含2 mol/L尿素的变性液重悬，搅拌溶解2 h;12000 r/min离心20 min;将沉淀用含6 mol/L尿素的变性液重悬，搅拌至溶解;将Ni柱用平衡液平衡，加入变性蛋白液使目的蛋白与Ni柱结合，然后用含咪唑的洗脱液将目的蛋白从柱上洗脱，同时复性蛋白，收集蛋白峰4℃保存备用。

1.7.2.3 用Western-blot对gB表位的特异性进行鉴定:经SDS-PAGE电泳后，将凝胶上的蛋白转印至PVDF膜上，放入含有封闭液的平皿中，封口后4℃封闭过夜。然后用0.1 mol/L的PBS洗涤三次，加入用封闭液配制的1∶1000倍稀释的His·Tag多克隆抗体，37℃作用1 h，PBS漂洗三次。加入1∶500倍稀释的辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗，37℃作用1 h。用PBS漂洗三次。加入DAB显色液，室温显色待观察到明显条带时用纯水终止反应。拍摄照片后干燥保存反应膜。

1.7.2.4 gB-26肽表位ELISA方法的建立:96孔ImmobilizerTM-氨基酶标板(Nunc)每孔分别包被100～500 ng gB-26肽和gD-9肽表位合成肽，不盖盖，37℃过夜;用100%甲醇室温固定15 min，每孔100 μL;扣干后用洗涤液洗涤，3×5min;加入封闭液(含3%BSA)室温封闭 1 h，每孔200 μL;扣干后用洗涤液洗涤，3×5 min;加入稀释液(含1%BSA)1∶50倍稀释的待检血清，每孔 100 μL，37℃ 孵育 90 min;扣干后用洗涤液洗涤，3×5 min;加入稀释液(含0.02%Tween-20)1∶(4000～12000)倍稀释的SPA，每孔 100 μL，37℃孵育 40 min;扣干后用洗涤液洗涤，3×5 min;用 OPD显色，37℃ 15 min;终止液终止反应，酶标仪450 nm读数。

1.7.2.5 gB-26肽表位ELISA方法的评估:将人工合成的gB-26肽与gD-9肽分别包被于酶标板上，对相同42份血清进行ELISA检测，比较其检测结果1～6列为9肽包被;7～12列为26肽包被(图1)。A～G排分别加入阳性血清和阴性血清，H排分别加入4份小鼠血清和2份空白对照。

图1 gB-26肽与gD-9肽ELISA 96孔板加样示意图Fig.1 The ELISA microplate delineation of gB-26 peptide and gD-9 peptide

2 结果

2.1 猴B病毒囊膜蛋白gB的信号肽序列

利用生物序列分析中心CBS(Center for Biological Sequence Analysis)的SignalP 3.0 Server程序分析猴B病毒囊膜蛋白gB的氨基酸序列，预测得出其信号肽序列第34和35位氨基酸处。

2.2 猴B病毒囊膜蛋白gB的胞外区

利用生物序列分析中心CBS(center for biological sequence analysis)的TMHMM Server v.2.0程序，分析猴B病毒囊膜蛋白gB的氨基酸序列，预测得出其胞外区是第1个氨基酸至第762个氨基酸，跨膜区是第763个氨基酸至第785个氨基酸、胞内区是第786个氨基酸至第892个氨基酸。

2.3 预测猴B病毒囊膜蛋白gB的抗原表位

利用IEDB网站的Epitope Prediction andAnalysis Tools、DNASTAR软件中的 Protean Program程序，分别对猴B病毒囊膜蛋白gB的氨基酸序列进行抗原表位的预测。鉴于抗原表位预测结果的准确率在15%～75%之间，因而不同工具的抗原表位预测结果有少许的不同(图2a，2b，见彩插Ⅲ)。图2a中横线上方黄色区域表示表位可能分布区域，图2b中黑线上方红色区域表示表位可能分布区域。

2.4 筛选猴B病毒囊膜蛋白gB的抗原表位

根据表位预测和猴B病毒囊膜蛋白gB特异性序列分析，从gB蛋白上筛选出gB-24、gB-25、gB-26、gB-284个抗原表位，其氨基酸序列如下:gB 24肽(32-55)aaatpvvsp raspappvpa atptf;25肽(56-80)pdddn dgeagaapga pgtnasveag;26肽(43-68)spappvpa atptfpdddndgeagaap;28肽(453-480)rellreqe rrpgdaaatp kpsadppdve。

2.5 目的表位基因片段的克隆

以阳性质粒pET32-gB为模板，经PCR扩增后，在用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，出现DNA条带，约为100 bp，与预期结果相一致(图3)。

图3 gB四表位基因片段PCR扩增电泳图Fig.3 The PCR product of four eiptope of gB

2.6 gB筛选表位的原核表达

将这4个表位核酸片段分别插入原核表达载体pET32b(+)中进行原核表达。转化BL21(DE3)感受态细胞进行培养，菌液中加入IPTG至终浓度1mmol/L进行诱导表达，分别于诱导前后进行采样，最后对处理后的样品进行SDS-PAGE鉴定，在27×103处出现融合蛋白(图4)，图中可见3泳道的gB-26肽表位蛋白量高。

2.7 gB-26肽表位表达蛋白过Ni柱纯化

大量培养表达gB-26融合蛋白克隆菌，经IPTG诱导后，用Ni柱纯化gB-26蛋白变性液，洗脱曲线中有两个峰，为峰1和峰2，用SDS-PAGE检测，洗脱液峰2中含有带His标签的gB-26融合蛋白 (图5a)。

图4 gB四表位SDS-PAGE电泳图Fig.4 The SDS-PAGE electropherogram of gB four eipitopes

2.8 gB-26肽表位Western-blot鉴定

将gB-26表位纯化后融合蛋白SDS-PAGE电泳后，转移至PVDF膜上，加上His抗体后又棕色条带出现(图5b)，表明纯化蛋白为目的表位蛋白。

图5 gB-26表位融合蛋白SDS-PAGE电泳图(5a)和Western-blot分析(5b)Fig.5 The SDS-PAGE electropherogram(5a)and Western-blot analyses(5b)of gB-26 epitope fusion protein

2.9 gB-26肽表位ELISA检测方法的建立

用梯度稀释法，确定了gB-26肽和gD-9肽两种抗原系统的ELISA方法，最佳工作条件如下:(1)gB-26肽:每孔包被200 ng;酶标抗体1∶10000。(2)gD-9肽:每孔包被100 ng;酶标抗体1∶10000。

2.10 gB-26肽表位ELISA检测系统的评估

分别以gB-26肽和gD-9肽为包被抗原，检测猴B病毒抗原片检测阳性血清和阴性血清各21份，gD-9肽的阳性率为76.2%，阴性率100%;gB-26肽的阳性率为42.9%，阴性率100%。结果表明筛选的gB-26肽表位与文献报道gD-9肽的阴性检测结果完全符合，阳性检测率稍低。

3 讨论

近年来，随着生物信息学的快速发展，其在表位预测和辅助鉴定方面的作用得到研究者的高度关注和认可，并已获得一定的发展和应用。Cha等［5］构建了肿瘤细胞NPLs，通过患者血清中的抗体筛选得到了肿瘤相关抗原表位。筛选自NPLs的表位引起的免疫应答更加接近于蛋白抗原激起的反应［6］。综合利用分子生物学、生物信息学和免疫学手段筛选出猴B病毒囊膜蛋白gB的抗原表位，对于B病毒诊断和多表位疫苗的研制具有重要意义。猴B病毒囊膜蛋白gB的胞外区部分是刺激机体产生抗体的有效抗原成分，当然，并不排除抗原的跨膜区和胞内区部分在刺激机体产生抗体的过程中也发挥着一定的作用，但有一点可以肯定的是抗原的胞外区部分较跨膜区和胞内区部分有更好的免疫原性和反应原性，因而我们偏向于在猴B病毒囊膜蛋白gB的胞外区部分寻找特异性的抗原表位。

表位预测主要依据蛋白质的二级结构、亲水性、表面可及性、抗原性指数以及柔韧性等参数，预测抗原的表位序列。目前开发的分析软件正是基于不同参数组合形成的数据库，因而预测的结果可能有较大差异。对比不同分析软件(准确性为15%～75%)的预测结果，既能提高预测的准确性，又尽可能覆盖所有表位。因此，我们综合多种分析软件的预测结果，并结合gB蛋白与其它病毒比较的特异区域，从而尽可能的提高抗原表位预测的准确性。

在对猴群B病毒抗体检测中，目前我国使用HSV-1作为BV的替代抗原，广泛应用于对于实验猴群B病毒抗体的常规检测。虽然B病毒与HSV-1具有共同抗原，B病毒免疫血清可以完全中和HSV-1抗原，但HSV-1免疫血清不能完全中和B病毒［7］。Perelygina以gD的特异性表位(氨基酸序列为GPARRGAPY，位于蛋白序列的362～370氨基酸残基)合成肽和重组蛋白作为ELISA或dot blot的检测抗原，特异性为100%，敏感性为67%［8］。肖镜等［9］进一步对该表位的特异性进行研究，检测结果与美国实验室BV抗体检测结果的符合率达85%。本文中用筛选出的gB-26肽表位作为检测抗原，与文献报道gD-9肽表位相比，特异性较强，但阳性检出率稍低。这提示我们单个表位的抗原性有较大差异，而且表位氨基酸片段大小可能对表位特异性也有关系。在感染动物体内，B病毒11种囊膜蛋白(分别为gB～gM)都能检测到相应的抗体，其中gB、gC、gD和gG的抗体滴度最高、出现时间最早(感染后7 d产生)，在体内驻留时间也最长(2年以上)。这提示我们可以进一步筛选特异性表位，并考虑多表位的串联来增强其特异性和敏感性。

［1］郭秀婵.B病毒感染及防治［J］.病毒学报，2005，21(6):481－484.

［2］Cohen JI，Davenport DS，Stewart JA，et al.Recommendations for prevention of and therapy for exposure to B virus［J］.MAJOR ARTICLE，2002，35:1191－1203.

［3］Tyler SD，Peters GA，Severini A.Complete genome sequence of cercopithecine herpesvirus 2(SA8)and comparison with other simplex viruses［J］.Virology，2005，331:429－440.

［4］李晓波，贺争鸣.猴B病毒检测技术研究与应用进展［J］.实验动物科学，2007，24(4):59－62.

［5］Cha SC，Kwak LW，Ruffini PA，et al.Cloning of B cell lymphoma-associated antigens using modified phage-displayed expression cDNA library and immunized patient sera［J］.J Immunol Methods，2006，312:79－93.

［6］Matthewsl J，Davis R，Smith GP.Immunogenically fit subunit vaccine components via epitope discovery from natural peptide librarie［J］.J Immunol，2002，169:837－846.

［7］周亚敏，李绍东，杨森富，等.猴疱疹病毒(B病毒)抗体检测方法的比较研究［J］.中国比较医学杂志，2005，15(4):237－239.

［8］Perelygina L，Zurkuhlen H，Patrusheva I，et al.Identification of a herpes B virus-specific glycoprotein D immunodominant epitope recognized by natural and foreign hosts［J］.J Infect Dis，2002，186:453－461.

［9］肖镜，付瑞，贺争鸣，等.猴B病毒BVgD多肽ELISA检测方法的建立［J］.实验动物科学，2008 25(2):20－24.

Selection and Identification of Specific Antigen Epitope in Monkey B Virus Envelop Protein gB

ZHANG Xiao-fei，YE Hua-hu，ZHAO Yan-bin，WANG Dong-ping，ZHAO Hong-wei，BAI Jie-ying
(Laboratory Animal Center，Academy of Military Medical Science，Beijing 100071，China)

Objective To select and identify B virus envelop protein gB specific antigen epitope and to apply to the detection of B virus.Methods Using protein sequence comparison and epitope prediction to select the gB specific antigen eitope.Then obtaining the fusion protein by prokaryon expression and Western-blot assessment，building the ELISA method to detect epitope and evaluating the effects.Results The gene sequence of epitopewas completely correct，the molecular weight of recombination protein identifying by Western-blot was about 27×103.The gB-26 epitide was better in specificity and lower in sensitivity.Conclusion Building up methods to selecet and identify specific antigen eitope.

B virus;Envelop protein gB;Antigen epitope;Selection;Identification

512.92

A

1671-7856(2010)10-0010-05

10.3969/j.issn.1671.7856.2010.10.004

2010-06-25

图2 Epitope prediction and analysis tools(a)和protean program程序(b)的抗原表位预测结果
Fig.2 The prediction of antigen epitope using epitope prediction and analysis tools(a)and protean program (b)

注：横轴表示氨基酸数；a中横线上方黄色区域表示表位可能分布区域，b中黑线上方红色区域表示表位可能分布区域。
Note: horizontal axis means number of animo acids; yelloW area means prediction epitope in a， red area above the black line means prediction epitope in b.

军事医学科学院科研创新基金资助。

张小飞(1979－)，女，博士，主要从事实验动物微生物学研究。E-mail:wangyizxf@163.com

白杰英(1977－)，男，博士，副主任，主要从事实验动物免疫与生物化学研究。E-mail:baijieying@126.com