印度尼西亚源食蟹猴干扰素-γ基因的克隆和序列分析

孙兆增，李爱学，孔德强，赵 爽，赵彦斌，刘 冰，时彦胜，曾 林

(军事医学科学院实验动物中心，北京 100071)

印度尼西亚源食蟹猴干扰素-γ基因的克隆和序列分析

孙兆增，李爱学，孔德强，赵 爽，赵彦斌，刘 冰，时彦胜，曾 林

(军事医学科学院实验动物中心，北京 100071)

目的 获得印度尼西亚食蟹猴的干扰素-γ基因，为常用实验猕猴干扰素-γ的基因工程生产奠定基础。方法 根据GenBank上公布的恒河猴干扰素-γ基因序列设计特异性引物，从印度尼西亚食蟹猴的外周血液中分离单核淋巴细胞，利用Trizol试剂，提取淋巴细胞的总RNA，通过RT-PCR的方法获得干扰素-γ基因片段，并对该片段进行克隆、鉴定和序列分析。结果 扩增到一498 bp的目的片段，经序列测定证实为印度尼西亚食蟹猴的干扰素-γ基因，与恒河猴、人及狒狒的干扰素-γ基因相比，同源性分别为100%、96%、99%。结论 常用的两种实验猕猴食蟹猴与恒河猴的干扰素-γ基因完全相同。

印度尼西亚源食蟹猴;干扰素-γ;克隆;序列分析

干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)是由活化的 T淋巴细胞和NK细胞在诱生剂的作用下产生的一种细胞因子，由于其具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等独特作用，在动物传染性疾病的预防和治疗中具有广阔的应用前景［1，2］。自 Isaacs 和 Lindenmann［3］于1957年首次发现干扰素的存在以来，各种动物和类型的干扰素相继被发现并克隆［4－9］。与其它干扰素类似，IFN-γ生物学作用有较严格的种属特异性，如人和小鼠的IFN-γ在DNA水平上有65%左右同源性，在氨基酸水平的同源性只有40%左右［10，11］。

目前在非人灵长类动物疾病防控过程中主要应用人源干扰素。恒河猴的IFN-γ由166个氨基酸组成，与人的同源性为96%。对于食蟹猴的干扰素-γ基因，国内外的研究报道较少，本研究拟获得印度尼西亚食蟹猴的干扰素-γ基因片段，并与其它种属的干扰素-γ基因序列进行比较，为常用实验猕猴干扰素-γ的基因工程生产奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

4只印度尼西亚源食蟹猴，由军事医学科学院实验动物中心提供［SCSK-(军)2002-001］。

1.2 主要试剂

人淋巴细胞分离液购自天津TBD公司;Trizol购自Invitrogen公司;反转录酶M-MLV和DEPC为Promega公司产品;凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自杭州 BioFlux公司;LA-Taq、dNTP、Oligo(dT)、pMD18-T克隆载体、EcoRⅠ及HindⅢ内切酶均为大连宝生物公司产品;E.coli DH5α感受态为北京博迈德公司产品。

1.3 引物合成

根据GenBank上公布的恒河猴的干扰素-γ序列设计引物，其上游序列引物为:5′-atgaaatacacaagttatat-3′，下游引物序列为:5′-ttattgggatgctcttcgac-3′，由上海生物工程技术有限公司合成。

1.4 外周血单核细胞的分离和总RNA的提取

无菌采取食蟹猴的外周血各4mL，肝素抗凝。取2mL抗凝血与2mL的Hank’s液充分混合，缓慢加入到2mL淋巴细胞分离液之上，1500 g离心10 min;去掉上层的水相，将包含淋巴细胞的中间层全部转移到1.5mL的离心管中，2000 r/min离心10 min，收集淋巴细胞。用 DEPC水洗涤后，转入到DEPC处理过的离心管中，加入1mL的Trizol，按照Trizol试剂说明书，提取总RNA。

1.5 食蟹猴IFN-γ基因的RT-PCR扩增

以提取的总RNA为模版，以olig(dT)为反转录引物，进行反转录反应。反应条件为:42℃，1 h;95℃，5 min;4℃，5 min。以2 μL 的反转录产物为模版，利用LATaq酶扩增食蟹猴干扰素-γ基因。反应条件为:预变性95℃，4 min;30 个循环，95℃，30 s，54℃，40 s，72℃，1 min;最后 72℃延伸 7 min。利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果，并用凝胶回收试剂盒回收基因片段。

1.6 食蟹猴IFN-γ基因的克隆、鉴定及序列分析

PCR产物回收、纯化后，与pMD18-T载体连接。连接产物转化至DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选。挑取单个白色转化菌落，接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，利用质粒提取试剂盒提取质粒，通过PCR和酶切结合的方法筛选阳性重组子，阳性重组子由北京鼎国生物工程公司测序。利用DNAMAN软件编辑测序序列，并与GenBank上公布的恒河猴、人及狒狒的IFN-γ序列进行同源性分析。

2 结果

2.1 外周血单核细胞总RNA的提取结果

利用Trizol试剂从食蟹猴外周血淋巴细胞中提取到总RNA，rRNA的三条带比较明显，没有明显的降解(图1)。

图1 外周血单核细胞总RNA的提取结果Fig.1 The results of total RNA extraction of peripheral blood mononuclear cells

2.2 食蟹猴IFN-γ基因的RT-PCR扩增

以食蟹猴外周血单核细胞中提取的总RNA为模版，进行反转录反应。利用反转录产物为模版，从两只食蟹猴的反转录产物中扩增到IFN-γ的基因片段，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到长度约为500 bp的特异性DNA片段(图2)，与预期片段的大小一致。

图2 食蟹猴IFN-γ基因RT-PCR扩增结果Fig.2 RT-PCR results of IFN-γ gene of Cynomolgus monkeys

2.3 重组质粒的酶切和PCR鉴定

用EcoRⅠ、HindⅢ进行重组克隆质粒的双酶切分析，并以重组克隆质粒为模板进行PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示，获得了两个阳性重组质粒(图3)。

图3 IFN-γ阳性质粒的鉴定结果Fig.3 Identification of the IFN-γ positive plasmids

2.4 IFN-γ基因的测序和序列比较

两个阳性质粒序列测定的结果表明，食蟹猴IFN-γ全长为 498 bp，编码 166个氨基酸，与GenBank上公布的恒河猴IFN-γ的同源性为100%(序列比对图略)，不存在种间差异。与人的IFN-γ相比，同源性为96%;与狒狒的同源性为99%，仅有5个碱基不同。

3 讨论

目前国内共有食蟹猴饲养场39家，其存栏量超过20万只。食蟹猴的疾病防控在其规模化生产中具有重要作用。目前在非人灵长类兽医临床中多应用抗生素等常规药物，基因工程药物应用基础薄弱。基因工程干扰素与血源性干扰素相比，具有无污染、安全性高、纯度高、比活性高、成本低、疗效确切等优点，是应用最成功的基因工程药物。但目前国内外对食蟹猴干扰素的研究报道较少，本研究通过PT-PCR方法对食蟹猴IFN-γ的序列进行了克隆，并进行了序列分析，为下一步食蟹猴IFN-γ的基因工程生产奠定基础。

序列分析结果表明食蟹猴IFN-γ基因序列与恒河猴IFN-γ基因序列完全相同，与人的同源性为96%，与狒狒的同源性为99%，仅有5个碱基不同。国内外用于实验的非人灵长类动物主要包括恒河猴和食蟹猴，本研究表明食蟹猴与恒河猴的IFN-γ基因不存在种间差异，利用本研究获得的IFN-γ序列进行基因工程生产，可广泛应用到非人灵长类的兽医临床中。

［1］Farrar MA，Schreiber RD.The molecular cell biology of interferon-gamma and its receptor［J］.Annu Rev Immunol，1993，11:571－611.

［2］潘晓梅，窦永喜，才学鹏.猪干扰素-γ的研究进展［J］.生物技术通报，2008，6:36－39.

［3］Isaacs A，Lindenmann J.Virus interference I the interferon［J］.Proc R Soc Lond B Biol Sci，1957，147:258－267.

［4］娄忠子，兰喜，李建强，等.猪γ2干扰素的克隆表达及单抗的潜在应用［J］.生物技术通报，2010，1:173－179.

［5］李林，余为一，张敬梅，等.猪γ干扰素基因的克隆表达及其抗原性的初步研究［J］.安徽农业大学学报，2010，37:32－35.

［6］孟庆玲，乔军，才学鹏，等.兔IFNγ基因的克隆、遗传进化分析及其表达［J］.甘肃农业大学学报，2008，43:7－11.

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［8］丁忠庆，刘胜旺，孔宪刚.鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达及多克隆抗体的制备［J］.中国兽医学报，2004，24:255－257.

［9］史喜菊，汪明，夏春.牛干扰素研究进展［J］.中国兽医杂志，2005，41:14－16.

［10］朱颖慧，朱兰才，刘然义，等.干扰素-γ治疗肿瘤的研究进展［J］.肿瘤学杂志，2008，14:4－9.

［11］刘林林，郭彩霞，孙宝胜，等.小鼠分泌型γ干扰素原核表达载体 pFLAG-IFN-γ的构建［J］.中国实验诊断学，2009，13:863－865.

Cloning and Sequence Analysis of Interferon-γ of Indonesian Cynomolgus Monkeys

SUN Zhao-zeng，LI Ai-xue，KONG De-qiang，ZHAO Shuang，ZHAO Yan-bin，LIU Bing，SHI Yan-sheng，ZENG Lin
(Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Science，Beijing 100071，China)

Objective To obtain the IFN-γgene of Indonesian Cynomolgus monkeys and provide a theoretical and material basis for the production of the recombinant IFN-γ.Method Based on the published nucleotide sequence of IFN-γ gene of rhesus monkey in GenBank，a pair of RT-PCR primers were designed and synthesized.Total RNA，isolated from the peripheral blood mononuclear cells by Trizol，was used as template to amplify the IFN-γgene by RT-PCR.The gene was identified by endonuclease，PCR and DNA sequencing.Result A 498 bp DNA fragments were amplified.DNA sequencing confirmed that the fragment was IFN-γof Cynomolgus monkeys.Compared with rhesus monkeys，humans and baboons，the homology of nucleotide sequence of IFN-γgene were 100%，96%and 99%respectively.Conclusion The IFN-γ gene of cynomolgus monkey was identical to that of rhesus monkey.

Indonesian Cynomolgus monkeys;IFN-γ;Cloning;Sequence analysis

R349.64

A

1671-7856(2010)10-0003-03

10.3969/j.issn.1671.7856.2010.10.002

2010-06-12

国家自然基金(30970416)，国家科技部基础平台项目(2005DKA21500)。

孙兆增(1977－)男，博士，研究方向:实验动物学。

曾林(1965－)男，研究员，研究方向:实验动物科学与管理。