鸡胚宫颈癌模型的建立及其生物学特性

汤 球，崔淑芳，蔡丽萍，江鹏亮

(第二军医大学实验动物学教研室，上海 200433)

鸡胚宫颈癌模型的建立及其生物学特性

汤 球，崔淑芳，蔡丽萍，江鹏亮

(第二军医大学实验动物学教研室，上海 200433)

目的 建立人宫颈癌鸡胚模型，探讨其形态学及生物学特性。方法 将Hela细胞接种于鸡胚绒毛尿囊膜，观察影响宫颈癌鸡胚移植瘤成活可能的因素、移植瘤生长特性、形态、生物学特性。结果 成功建立了人宫颈癌鸡胚移植瘤模型。移植后瘤易于生长，具有较强的血管诱导作用。光镜下显示移植后瘤具有与人宫颈癌相似的组织结构。结论 该模型容易建立，能动态观察宫颈癌诱导血管生成的全过程，可用于宫颈癌的实验研究。

宫颈癌;鸡胚尿囊膜;血管生成

宫颈癌是全球发病率居第二位的妇女恶性肿瘤，每年都有几十万妇女死于宫颈癌［1］，目前治疗手段仍有不足之处，急需研究合理的综合治疗方案。建立宫颈癌动物模型，对进一步了解宫颈癌的发病机制有着十分重要的作用，从而对临床中有效预防和治疗宫颈癌将起关键作用。本研究拟运用人宫颈癌Hela细胞，建立人宫颈癌鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤模型，并探讨其生物学特征。

1 材料和方法

1.1 Hela细胞培养与鸡胚孵育

人宫颈癌Hela细胞由第二军医大学细胞生物学教研室赠送，常规方法复苏HELA细胞，接种于含为0.1(体积分数)胎牛血清和100 U/mL的青霉素的 RPMI－1640 培养液中，置于37.0℃，0.05(体积分数)CO2培养箱中培养，收集对数生长期的Hela细胞。德国伊沙鸡种，购自北京实验养鸡场，受精鸡种蛋经消毒放入于温度37.0℃，相对湿度60%～80%的恒温孵箱中孵育，胚头斜向上方，鸡蛋长轴与蛋托约成45°，每天前俯后仰翻蛋3次，孵育备用。

1.2 Hela细胞接种

在超净工作台上在胚蛋气室上方开直径约3mm圆形小孔，在胚头下方1.0cm处开窗，大小约1.0cm×1.0cm，负压吸引气室上方小孔，开窗处分离壳膜。用微量加样器准确吸取一定体积的宫颈癌Hela细胞悬液，接种至相对无血管区，灭菌透明胶带封闭窗口，继续孵育。操作方法参考王利宏［2］，但有适当改进。

1.3 实验处理

1.3.1 Hela细胞接种数量的影响:取孵育较好的一周龄胚蛋30只，随机分为5组，每组6只。用0.01 mol/L PBS稀释液将Hela细胞浓度调整为每0.1mL含细胞数量分别为1.0×106，2.0×106，4.0×106，8.0×106个，4种不同浓度的细胞悬液分别接种4组鸡胚绒毛尿囊膜(按接种细胞数量由低至高分别接种至 A，B，C，D四组)，每胚蛋接种0.1mL。对照组每只接种PBS稀释液0.1mL。接种后继续孵育7 d，以接种区为中心，直径3cm取下鸡胚绒毛尿囊膜。以可见胚胎活动判断为鸡胚存活情况，观察接种区肿瘤大小，用游标卡尺测瘤体长径(a)、宽径(b)，长径≥2mm判为成瘤阳性。

1.3.2 鸡胚胚龄的影响:分别取孵育7、9、11、14 d的胚蛋各6只，每只接种含4.0×106个细胞的肿瘤细胞悬液0.1mL后，继续孵育一周，观察并记录鸡胚存活与成瘤情况。

1.4 形态观察

镜下观察:取移植瘤样本，经甲醛固定、石蜡包埋、切片及HE染色后光镜下观察各自形态。

1.5 血管生成情况观察

取孵育良好的11日龄胚蛋24只并随机分为实验和对照两组。实验组每只接种含4.0×106个细胞的悬液0.1mL，对照组每只接种 PBS缓冲液0.1mL。接种后每日每组取3只胚蛋，以移植瘤(或接种区)为中，直径3cm取绒毛尿囊膜，平铺于透明的大玻璃片上，解剖显微镜下观察移植瘤诱导的血管生成情况。

1.6 统计学处理

数据采用SPSS15.0统计软件分析。

2 结果

2.1 接种宫颈癌细胞数量对鸡胚存活率和移植瘤成瘤率的影响

鸡胚存活率与接种细胞数量呈负相关，每胚蛋接种细胞数为8.0×106个时，鸡胚存活率显著低于1.0×106组和2.0×106组，对照组鸡胚全部存活。成瘤阳性率随接种细胞数量的增加而升高，接种细胞数量为每胚蛋2.0×106或4.0×106个时，成瘤阳性率高于1.0×106组，但接种细胞数继续增加至每胚蛋8.0×106个时，成瘤阳性率亦随之降低。对照组未见成瘤(表1)。

表1 接种宫颈癌细胞数量对鸡胚存活率和移植瘤成瘤率的影响Tab.1 Effects of the number of inoculated cervical cancer cells on the survival rate of chicken embryos and the tumor formation rate

2.2 接种鸡胚胚龄对鸡胚存活率和移植瘤成瘤率的影响

鸡胚存活率与接种时的胚龄成正相关，7日龄鸡胚组接种时，鸡胚存活率显著低于11日龄、14日龄鸡胚组(P ＜0.05)。11日龄、14日龄鸡胚接种时，成瘤阳性率显著高于7日龄鸡胚组(P＜0.05)。11日龄鸡胚组成瘤率高于14日龄，但差异不显著(表2)。

表2 接种鸡胚胚龄对鸡胚存活率和移植瘤成瘤率的影响Tab.2 Effects of embryonic age on the survival rate of chicken embryos and the tumor formation rate

2.3 移植瘤形态观察

肉眼见宫颈癌鸡胚移植瘤呈红色，与鸡胚绒毛尿囊膜边界清晰，可见血管长入移植瘤内。瘤组织质硬，切面灰红;光镜下见移植瘤组织与子宫颈癌组织结构相似，肿瘤细胞核大小不一、形态怪异，染色质深染，核仁显著，可见畸形多核细胞及异常核分裂相(图1)。

2.4 宫颈癌对血管生成的诱导作用

接种Hela细胞组，接种后第1天，接种区未见新生血管，鸡胚原有血管未见致弯曲现象。第2天瘤体周围有部分宿主血管向其弯曲，靠近。第3天以后瘤体周围血管逐渐变粗，并可见新生血管向移植瘤呈放射状集中。第5天新生血管长入移植瘤内，瘤内及四周可见大量血管分布(图2)。对照组血管分布成树枝状，血管舒展平滑(图3)。(图1～3见彩插Ⅲ)。

3 讨论

宫颈癌是一种严重威胁女性健康和生命安全的恶性肿瘤［3，4］，近年来宫颈癌的治疗手段有了改进，但其生存率仍然有待提高，宫颈癌的动物模型对提高宫颈癌的实验研究水平具有重要意义。有人用BALB/c－nude、SCID小鼠或大鼠作为人宫颈癌移植瘤的动物模型［5－7］。鸡胚作为人类疾病模型有许多优点［8］，有人把鸡胚作为其它癌细胞如人结肠癌细胞系HT－29、成釉细胞瘤细胞、骨肉瘤细胞移植受体［9，10］，或作为肿瘤新生血管形成、肿瘤侵袭和远处脏器转移潜能，以及抗肿瘤药物作用机制探讨等方面研究的体内实验模型［11］，为建立宫颈癌鸡胚模型提供了可能性与借鉴方法。

本实验首先探明了接种细胞数、鸡胚胚龄与宫颈癌移植瘤成瘤阳性、鸡胚存活率率的影响:即鸡胚存活率与接种细胞数成负相关，与接种鸡胚日龄呈正相关。成瘤阳性率则与接种细胞数在一定范围内成正相关，当接种数量超过一定范围时，成瘤率反而降低;同样，鸡胚胚龄在7日龄～11日龄时，成瘤率与胚龄呈正相关，但超过11龄时，成瘤率下降，与其它肿瘤鸡胚模型研究所得出的结论相比，基本变化规律是一致的，只是具体适宜的接种细胞数及接种鸡胚日龄却因肿瘤细胞不同而不同:如卵巢癌接种细胞数低于107不能成瘤［12］，人骨肉瘤接种适宜采用9日龄鸡胚，本研究表明制备宫颈癌鸡胚模型，接种细胞个数为2.0×106或4.0×106，选择11日龄鸡胚作为受体，可以获得理想的成瘤阳性率。在预实验中，我们尝试采用5日龄、6日龄鸡胚接种，但效果不理想，实验中7日龄、9日龄鸡胚组接种，成瘤阳性率都不理想，这与制备成釉细胞瘤、骨肉瘤等其它肿瘤鸡胚模型时所得到的结论有差距:通常适宜接种的鸡胚日龄为7～10 d，但宫颈癌的适宜鸡胚日龄达到11 d，可能表明成瘤率与Hela细胞自身特性密切相关。

我们还通过实体显微镜、光学显微镜和免疫细胞化学染色法对宫颈癌移植瘤的形态学特征以及诱导血管生成情况作了初步探讨，观察到移植瘤组织结构、质地、切面颜色等特征与人类宫颈癌基本一致，并在接种后观察到宫颈癌诱导血管生成的过程及结果，这为抗Hela细胞增值及抗血管生成的相关研究提供了一种新载体，与建立宫颈癌小鼠、大鼠模型相比，建立鸡胚宫颈癌模型具有制备方法简单、周期短，成本低，符合动物福利原则的优势。而相比于离体细胞模型，鸡胚模型更符合系统论观点［13］。宫颈癌鸡胚模型的建立，为进一步研究肿瘤转移与侵袭提供了可能。但鸡胚系尚未发育完全的胚胎组织，在结构与代谢功能上，与大、小鼠及人类相比有较大差距，需要引起研究者关注。

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［2］王利宏，蔡林.人骨肉瘤鸡胚移植瘤模型的生物学特性研究［J］.现代肿瘤医学，2007，15(11):1536－1538.

［3］Brake T， LambertPF.Estrogen contributesto the onset，persistence，and Malignant progression of cervical cancer in a human papillomavirus－transgenic mouse model［J］.PNAS，2005，102(7):2490－2495.

［4］Rock CL，Michael CW，Reynolds RK.Prevention of cervix cancer［J］.Crit Rev Oncol/Hematol，2000，33(3):169－185.

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［6］许恬怡，凌斌，王群华，等.SCID鼠人宫颈癌组织模型的建立及其生物学特性初探［J］.安徽医科大学学报，2005，40(6):541－543.

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［13］孙伟.运用系统论原理复制人类疾病动物模型［J］.中国比较医学杂志，2008，18(10):67－69.

Establishment and Biological Characteristics of Cervix Cancer Model on Chick Embryo Chorioallantoic Membrane

TANG Qiu，CUI Shu－fang，CAI LI－ping，JIANG Peng－liang
(Laboratory Animal Centre of the Second Minitary Medical Unniversity，Shanghai 200433，China)

Objective To establish cervix cancer model on the chick embryo chorioallantoic membrane and to study its biological characteristics.Methods Cervix cancer cells were implanted on the chick embryo chorioallantoic membrane.The factors which affect the implanted tumors and the morphological and biological characteristics of the tumors were studied.Result Human cervix cancer model was successfully established.The implanted tumors grew easily on the chick embryo chorioallantoic membrane and had a strong trend of angiogenesis and similar structure as human cancer of the cervix with microscopic verification.Condusion This model is of easy duplication，and could be used in the experiment research for human cancer of the cervix.

Cervix cancer;Chick embryo chorioallantoic membrane;Angiogenesis

Q95－33

A

1671－7856(2010)10－0019－04

10.3969/j.issn.1671.7856.2010.10.006

2010－06－21

图1 人宫宫颈癌鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤组织形态（HE染色，x400）
Fig.1 The morhpology of human cervical tumor in chicken chorioallantoic membrane （HE，x400）

图2 人宫颈癌鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤诱导血管形成（第5天）
Fig.2 The angiogenesis of human cervical tumor in chicken chorioallantoic membrane （the 5th day）

图3 接种PBS缓冲液鸡胚绒毛尿囊膜血管生长情况（第5天）
Fig.3 The angiogenesis in chicken chorioallantoic membrane inoculated by PBS（the 5th day）

汤球(1971－)，男，硕士，讲师，研究方向:人类疾病动物模型。E－mail:tangqiu1999@163.com