花生油对2型糖尿病大鼠海马CA1区神经生长因子及胆碱乙酰转移酶表达的影响

许秋岩，赵咏梅，赵志炜，姬志娟，闫 颖

(1.首都医科大学宣武医院 神经变性病教育部重点实验室，北京 100053;2.中央民族大学医院眼科，北京 100081)

花生油对2型糖尿病大鼠海马CA1区神经生长因子及胆碱乙酰转移酶表达的影响

许秋岩1，2，赵咏梅1，赵志炜1，姬志娟1，闫 颖1

(1.首都医科大学宣武医院 神经变性病教育部重点实验室，北京 100053;2.中央民族大学医院眼科，北京 100081)

目的 通过观察2型糖尿病大鼠海马CA1区神经生长因子(NGF)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)表达的改变，研究花生油对2型糖尿病大鼠海马神经元NGF及ChAT表达的影响，探讨花生油在防治糖尿病脑病中的作用。方法 60只健康雄性SD大鼠随机分为4组:正常对照组(C组)、2型糖尿病组(T2DM组)、2型糖尿病给予2mL花生油组(T2DM+2mL组)及2型糖尿病给予5mL花生油组(T2DM+5mL组)。其中C组给予正常饮食，糖尿病组大鼠给予高脂饮食喂养，2个月后，按25 mg/kg体质量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制成2型糖尿病模型，T2DM组、T2DM+2mL组及T2DM+5mL组大鼠继续给予高脂饮食。糖尿病造模1个月后处死全部大鼠，行脑冰冻切片，用免疫组织化学方法检测各组大鼠海马CA1区NGF和ChAT的表达。结果(1)T2DM组大鼠海马CA1区NGF表达比C组明显降低(P＜0.05)，T2DM+2mL组及T2DM+5mL组大鼠海马CA1区NGF表达均明显高于未给予花生油的T2DM组(P＜0.05)。(2)T2DM组大鼠海马CA1区ChAT表达显著低于C组(P＜0.05)，T2DM+2mL组和T2DM+5mL组大鼠海马CA1区ChAT表达均明显高于未给予花生油的T2DM组(P＜0.05)。结论 2型糖尿病大鼠海马CA1区神经生长因子表达降低，胆碱能神经元数量减少，这可能是2型糖尿病脑病发生的原因之一。花生油能增加2型糖尿病大鼠海马区内神经生长因子表达，促进胆碱能神经元存活，表明花生油具有一定的保护大鼠糖尿病脑病的作用。

2型糖尿病;神经生长因子;胆碱乙酰转移酶;花生油;大鼠

随着生活水平的提高，2型糖尿病(type 2 diabetic mellitus，T2DM)的发病率在全世界范围内逐年增加。目前已有大量研究表明糖尿病可造成认知功能障碍，以获得性认知和行为缺陷为特征，称为糖尿病脑病(diabetic encephalopathy)［1］。糖尿病脑病的神经生理学和影像学特点与老年性痴呆(Alzheimer’s disease，AD)十分相似，因此，糖尿病是 AD 的危险因素［2，3］。

花生、花生油的营养很丰富，富含油酸、亚油酸等成份，其中油酸为单不饱和脂肪酸，具有降低高血脂症患者血脂水平以及预防心血管疾病的作用，每日进食少量花生能降低患2型糖尿病的危险性［4，5］。本课题组以往的研究表明花生油具有降低2型糖尿病大鼠血脂、血糖及调节其胰岛素分泌的作用［6］。本研究用花生油喂食2型糖尿病大鼠1个月，观察花生油对2型糖尿病大鼠海马区神经生长因子(NGF)及胆碱乙酰转移酶(ChAT)表达的影响，探讨花生油在防治糖尿病脑病中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

8周龄健康雄性 Sprague Dawley(SD)大鼠60只，体质量250～300 g，SPF级，购自中国医学科学院动物所。

1.2 主要试剂与仪器

链尿佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，兔来源的NGF、ChAT多克隆抗体(本研究室自行制备)，Sp免疫组化试剂盒(Zymed Laboratories公司)，花生油为购买于超市的普通食用花生油，血糖仪及血糖试纸购买于罗氏公司。

1.3 动物模型的制备及取材

60只SD大鼠随机分成4组:正常对照组(C组)、2型糖尿病组(T2DM组)、2型糖尿病给予2mL花生油组(T2DM+2mL组)及2型糖尿病给予5mL花生油组(T2DM+5mL组)。其中C组给予正常饮食，其余三组给予高脂饮食。2个月后，给予高脂饮食的三组大鼠腹腔注射少量STZ(按25 mg/kg体质量给药)，3 d后检测大鼠尾部非禁食血糖，大于15mmol/L认为2型糖尿病模型制作成功。T2DM组、T2DM+2mL组及 T2DM+5mL组大鼠继续给予高脂饮食，T2DM+2mL组大鼠在2型糖尿病造模同时每日给予2mL花生油灌胃，T2DM+5mL组大鼠每日给予5mL花生油灌胃。1个月后，大鼠按360 mg/kg体质量腹腔注射10%水合氯醛，麻醉成功后开胸暴露心脏，于大鼠左心室快速插管灌注生理盐水，同时剪开右心耳，用4℃预冷的4%多聚甲醛固定液(pH 7.4)快速灌流100mL后，再缓慢灌流30 min，至大鼠僵硬，肝脏变白，取脑组织浸于含30%蔗糖的4%多聚甲醛溶液，至脑下沉，用于免疫组织化学染色。

1.4 免疫组织化学染色及半定量分析

行大鼠海马部位冰冻切片，厚度为60 μm，分别进行NGF及ChAT抗体免疫组织化学染色。按说明书方法进行实验，具体步骤如下:3%过氧化氢室温20 min;PBS缓冲液洗3次，每次5 min;滴加5%的正常羊血清室温20 min;滴加Ⅰ抗(NGF抗体做1∶1 000稀释，ChAT抗体做 1∶500稀释)，4℃过夜，阴性对照不加一抗;次日，PBS缓冲液洗3次，每次5 min;滴加 II抗，山羊抗兔 IgG(1∶100)，室温孵育30 min;PBS缓冲液洗3次，每次5 min;用二氨基联苯胺(DAB)显色。光学显微镜观察。

免疫组化定量分析:每组大鼠各5只，每只大鼠于海马部位连续切片，每隔4张取1张，共取15张切片，在20倍物镜下分别记录4组大鼠海马 CA1区NGF及ChAT阳性染色细胞数目。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠海马 CA1区NGF免疫组织化学染色结果

C组大鼠海马CA1区内有大量深染的NGF阳性染色神经元，高倍镜下其胞核淡染，胞质和突起深染，突起分枝多，可见3～4级树突分支(图1A)。T2DM组大鼠海马CA1区内NGF阳性染色神经元数目比C组大鼠明显减少，染色浅(图1B)。T2DM+2mL组大鼠海马CA1区内NGF阳性染色神经元数目比未给予花生油的T2DM组大鼠增加(图1C)，T2DM+5mL组大鼠海马 CA1区内 NGF阳性染色神经元数目及染色程度比未给予花生油的T2DM组大鼠明显增加(图1D)。

2.2 大鼠海马CA1区ChAT免疫组织化学染色结果

C组大鼠海马CA1区表达ChAT的阳性神经元数目多，染色深 (图2A)，阳性细胞胞核基本不着色，胞浆和突起深染，突起多为树突，可见分支。T2DM组大鼠海马CA1区内ChAT阳性染色神经元数目及染色程度均比C组大鼠明显减少(图2B)。T2DM+2mL组大鼠海马CA1区内ChAT阳性染色神经元数目比未给予花生油的T2DM组大鼠明显增加，染色程度加深(图2C)，T2DM+5mL组大鼠海马CA1区内ChAT阳性染色神经元数目及染色程度比未给予花生油的T2DM组大鼠明显增加(图2D，图1，2见彩插1)。

2.3 免疫组织化学半定量分析结果

4组大鼠海马CA1区 NGF及 ChAT免疫组化阳性染色细胞数目比较见表1。

表1 4组大鼠海马CA1区NGF及ChAT阳性染色细胞数目比较(±s)Tab.1 Numerical comparison of cells stained positively with NGF and ChAT antibodies in the hippocampal CA1 area of the four groups of rats(±s)

表1 4组大鼠海马CA1区NGF及ChAT阳性染色细胞数目比较(±s)Tab.1 Numerical comparison of cells stained positively with NGF and ChAT antibodies in the hippocampal CA1 area of the four groups of rats(±s)

与C组相比，*P＜0.05;与T2DM组相比，#P＜0.05

n NGF ChAT C组分组Group 例数5 30.87±2.06 39.20±2.58 T2DM组 5 12.33±1.08* 8.73±1.16*T2DM+2mL组 5 17.53±2.25*# 20.40±1.22*#T2DM+5mL组 5 19.13±1.15*# 23.53±1.65*#

3 讨论

目前，越来越多的研究证实，糖尿病可造成以获得性认知和行为缺陷为特征的认知功能障碍，称为糖尿病脑病［1］。1型糖尿病人认知功能损害主要在联想记忆和学习技能注意力方面;2型糖尿病人认知功能损害主要在学习和记忆方面，可能存在记忆提取过程的缺陷。糖尿病脑病本身并无特征性的神经病理改变，尸检显示病理变化以AD的改变为主，血管性痴呆的改变为辅［2，3］。糖尿病脑病的发病机制复杂，其确切机制目前尚不完全清楚，但已经发现糖尿病脑病和老化的发病机制有着高度的相似性。

2型糖尿病在临床上以血糖增高为主要表现，以高胰岛素血症和胰岛素抵抗为病理基础。本课题组以往的研究表明，给大鼠高脂饮食2个月，可使大鼠产生高脂血症(高三酰甘油血症)、高胰岛素血症及轻度的血糖升高。之后再给大鼠腹腔注射亚致病剂量的STZ破坏部分胰岛β细胞功能，可导致大鼠血胰岛素和血糖水平明显高于对照组［6］。因此，本研究采用的动物模型较好地模拟了2型糖尿病的发生、发展过程。

NGF是神经营养因子家族的重要成员，能支持成熟神经元的存活。文献报道，NGF能够促进成年大鼠海马区谷氨酸及多巴胺的释放，从而激活神经存活信息转导途径，引起相关基因组有序的转录［7］。增加海马区NGF水平能够减少老化鼠的脑神经元凋亡，从而降低脑组织老化和神经元损害的风险［8］。本研究结果显示，2型糖尿病大鼠海马CA1区NGF表达比正常对照大鼠明显减少，说明2型糖尿病大鼠海马神经元处于低营养或营养缺乏状态，神经存活信息转导途径处于低激活状态，因此，2型糖尿病大鼠海马区神经元受损的危险性增加。ChAT是催化乙酰胆碱(Ach)合成的酶，也是胆碱能神经元的标志物。很多研究表明，胆碱能系统功能缺陷与AD密切相关，Ach活性不足是AD的早期异常表现，Ach减少的程度与痴呆的严重性呈正相关［9］。动物实验提示脑内 Ach不足与学习记忆能力缺陷有关［10］。本研究结果显示，2型糖尿病大鼠海马CA1区ChAT表达比正常对照大鼠明显减少，说明2型糖尿病大鼠胆碱能神经元变性丢失。NGF表达减少可能是导致2型糖尿病大鼠海马CA1区胆碱能神经元变性丢失的原因之一。NGF及胆碱能神经元数量减少可能与2型糖尿病引起的学习记忆损伤密切相关。本课题组已往的研究表明［11－13］，用STZ造模的1型糖尿病小鼠学习记忆能力下降、海马超微结构受损、神经营养因子和 NGF表达减少、ChAT表达减少，表明1型糖尿病小鼠存在糖尿病脑病。本研究结果显示，2型糖尿病大鼠海马CA1区NGF表达减少、ChAT表达减少，说明2型糖尿病大鼠亦存在糖尿病脑病。

花生、花生油的营养丰富，富含油酸、亚油酸等成份，其中油酸为单不饱和脂肪酸，摄入单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸能增强机体应用胰岛素的能力，因此，每日进食少量花生能降低患2型糖尿病的危险性［4，5］。油酸可使大鼠胰腺 β 细胞分泌胰岛素增加，给2型糖尿病KKAy小鼠喂食富含花生油中油酸成分的饮食可使其血糖水平比喂食不含油酸成分高脂饮食的2型糖尿病KKAy小鼠明显降低［14］。本课题组以往的研究表明，花生油可降低2型糖尿病大鼠血脂水平，并有可能通过调节胰岛素水平降低糖尿病大鼠的血糖［6］，说明花生油有防治2型糖尿病的作用。本研究结果显示，每日给予2mL或5mL的花生油可增加2型糖尿病大鼠海马CA1区NGF和 ChAT的表达，NGF及ChAT阳性染色细胞数目比未给予花生油的2型糖尿病大鼠明显增加，表明花生油有促进2型糖尿病大鼠脑内神经营养因子分泌、促进胆碱能神经元存活的作用。因此，花生油具有神经营养作用，能在一定程度上防治糖尿病脑病，其作用机理可能与花生油中的某些成分能调节糖尿病大鼠的血脂、血糖水平、调控胰岛素的分泌和作用有关，也可能与花生油中的油酸成分具有神经营养作用有关［15］，其具体机制尚有待进一步研究。

由于花生油是人们日常生活中的常用食品，没有任何毒副作用。花生油中单不饱和脂肪酸含量较高，平均45%左右，仅次于橄榄油，明显高于大豆油和菜籽油，且花生油价格比橄榄油优惠很多［16］，因此，花生油是2型糖尿病病人理想的食用油。2型糖尿病病人在控制总摄入热量的前提下，食用一定量的花生油可有助于预防糖尿病脑病的发生。

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Effect of Peanut Oil on Expression of NGF and ChAT in Hippocampal CA1 Area of Type 2 Diabetic Rats

XU Qiu－yan1，2，ZHAO Yong－mei1，ZHAO Zhi－wei1，JI Zhi－juan1，YAN Ying1
(1.Key Laboratory of Neurodegenerative Diseases，Ministry of Education，Xuan Wu Hospital，Capital Medical University，Beijing 100053，China;2.Department of Ophthalmology，Hospital of Minzu University of China，Beijing 100081，China)

Objective To study the expression of nerve growth factor(NGF)and cholineacetyltransferase(ChAT)in hippocampal CA1 area of type 2 diabetes rats and to investigate whether peanut oil has protective effect on diabetes encephalopathy.Methods Sixty healthy male SD rats were assigned randomly into 4 groups:normal control group(group C);type 2 diabetes mellitus group(group T2DM);type 2 diabetes mellitus treated with 2mL peanut oil group(T2DM+2mL group)and type 2 diabetes mellitus treated with 5mL peanut oil group(T2DM+5mL group).After two months of high－fat food feeding，type 2 diabetes mellitus was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ)in a low dose(25 mg/kg body weight).All the rats were killed at one month after the diabetes mellitus induction.The expression of NGF and ChAT in hippocampal CA1 area of rats was detected by immunohistochemical staining.Results(1)The expression of NGF in hippocampal CA1 area of T2DM group decreased significantly compared with that of control group(P＜0.05).The expression of NGF in hippocampal CA1 area of T2DM+2mL group and T2DM+5mL group increased significantly compared with that of T2DM group(P＜0.05).(2)The expression of ChAT in hippocampal CA1 area of T2DM group decreased significantly compared with that of control group(P＜0.05).The expression of ChAT in hippocampal CA1 area of T2DM+2mL group and T2DM+5mL group increased significantly compared with that of T2DM group(P＜0.05).Conclusion The expression of NGF and the number of cholinergic neurons decrease in the hippocampal CA1 area of type 2 diabetes rats.This might be one of the reasons that causes diabetes encephalopathy.Peanut oil improves the expression of NGF in hippocampal CA1 area and promotes the survival of cholinergic neurons in type 2 diabetes rats，suggesting that peanut oil has a protective effect on diabetic encephalopathy.

Type 2 diabetes mellitus;Nerve growth factor;Cholineacetyltransferase;peanut oil;Rat

R581.7

A

1671－7856(2010)08－0018－04

2010－04－08

教育部留学回国人员科研启动基金资助项目;北京市留学人员科技活动择优资助项目。

许秋岩(1973－)，女，副主任医师，E－mail:qiuyanxu@163.com。

赵咏梅(1968－)，女，博士，副研究员，电话:010－83198854，电子信箱:yongmeizhao@hotmail.com。