消癖汤对肝郁型乳腺增生病大鼠乳腺组织PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA表达的影响

王非，吴开明，常健菲，郑杨，高长玉，安平，宋春艳

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;3.黑龙江省中西医结合研究所，黑龙江 哈尔滨 150090)

消癖汤是在中医理、法、方、药的基础上制定的有效中药复方制剂，是在深入研究乳腺增生病的病因、病机的基础上，遵循中医整体观和辨证论治原则而确立的行之有效的中药复方。消癖汤在大量的临床诊治中，疗效颇佳，为深入探求其作用机制，本研究运用原位杂交技术观察消癖汤对肝郁型乳腺增生病大鼠乳腺组织的影响，现报道如下。

1 实验材料与方法

1.1 试验动物

选取Wistar雌性大鼠80只，体重200g左右，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供。

1.2 药品和试剂

消癖汤(柴胡、白芍、莪术、牡蛎等)、逍遥散中药饮片(黑龙江省中医药学会门诊部提供);苯甲酸雌二醇(天津金耀氨基酸有限公司，批号:0402271);黄体酮(天津金耀氨基酸有限公司，批号:0408231);三苯氧胺(辽宁康泰药业有限公司，批号:041003);增殖细胞核抗原(PCNA)、抑凋亡基因BcL－2、血管内皮生长因子(VEGF)原位杂交检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 实验仪器

AL204型电子天平(梅特勒－托利多仪器有限公司);HH·W21·Cu600型电热恒温水温箱(上海医疗器械七厂);DF205型恒温箱(50～250℃，北京医疗设备二厂);德国莱卡RM－2135型组织切片机(德国莱卡公司);Motic BA400型显微摄影系统(厦门麦克奥迪实业集团有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠乳腺增生模型的建立 将80只雌性大鼠，随机分为8组:正常对照组(A组)，疾病模型组(B组)，病证结合模型组(C组)，三苯氧胺组(D组)，逍遥散组(E组)，消癖汤高剂量组(F组)，消癖汤中剂量组(G组)，消癖汤低剂量组(H组)。

造模方法:A组肌注生理盐水0.2mL·只－1，每天1次，共30天。其他各组肌注苯甲酸雌二醇0.5mg·(kg·d)－1，连续 25d，继而改用肌注黄体酮 4mg·(kg·d)－1，连续 5d［1］。

病证造模:将C组、D组、E组、F组、G组、H组，每组都用纱布包裹尖端的止血钳夹鼠尾，使其与其它大鼠厮打，激怒同笼的其它大鼠，每次刺激30min，每天刺激1次，连续25d。

1.4.2 药物干预及标本采集 造模后，A、B、C组灌胃等体积蒸馏水，每天1次，连续30d。D组以三苯氧胺灌胃，1.8mg·kg－1。E、F、G、H 组灌胃相应浓度药液，末次给药后，各组大鼠禁食供水24h，取胸部第2、3对乳房的乳腺，用4%多聚甲醛/0.1MPBS(pH7.6)固定，含有1/1000 DEPC内，采用原位杂交技术测定PCNAmRNA、BcL－2mRNA和VEGFmRNA的阳性表达，操作步骤如下:(1)常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6μm。(2)玻片的处理:采用多聚赖氨酸。(3)石蜡切片经常规脱蜡至脱水。30%H2O21份+蒸馏水10份混合，室温10min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。(4)暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1mL 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃消化15min。0.5M TBS洗3次 ×5min。蒸馏水洗1次。(5)预杂交:湿盒的准备－干的杂交盒底部加20%甘油20mL以保持湿度。按每张切片20μL加预杂交液。恒温箱42℃4h。吸取多余液体，不洗。(6)杂交:按每张切片20μl杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱42℃杂交过夜。(7)杂交后洗涤:揭掉盖玻片，37℃水温的2×SSC洗涤5min×2次;0.5×SSC洗涤15min×1次;0.2×SSC洗涤15min×1次。(8)滴加封闭液:37℃30min。甩去多余液体，不洗。(9)滴加生物素化鼠抗地高辛:37℃60min。0.5M TBS洗5min×4次。(10)滴加 SABC－AP:37℃30min。0.5M TBS洗 5min×4次。(11)BCIP/NBT显色:BCIP/NBT(×20)按 1∶20的比例用 0.01M TBS(pH9.5)稀释，混匀。显色液加至标本上。37℃显色30min。充分水洗。(12)必要时苏木红复染30s，水洗。(13)中性树胶封片。

Motic BA400型显微摄影系统下观察其病理形态学变化，利用图象采集软件Motic images advanced 3.2采集图像并测量、处理图像。

1.4.3 统计学处理 运用 SPSS统计软件，利用方差分析及t检验的方法，进行数据分析处理，所有数据均以(±s)表示。

2 实验结果

由表1可见，B组、C组与A组比较，PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA的阳性表达明显升高，有显著性差异(P<0.01)。消癖汤中、高剂量组对乳腺增生大鼠乳腺组织中的PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA具有较强的抑制作用，且作用与逍遥散及三苯氧胺相似。结果见表1。

表1 大鼠乳腺组织PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA的表达(±s)

表1 大鼠乳腺组织PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA的表达(±s)

注:与 A 组比较，△P<0.05，△△P<0.01;与 B 组比较，*P<0.05，**P<0.01;与 C 组比较，●P<0.05，●●P<0.01。

组别nPCNAmRNA(平均光密度)BcL－2mRNA(平均光密度)VEGFmRNA(平均光密度)9 0.14±0.01 0.17±0.03 0.20±0.02 B组 9 0.20±0.01△△ 0.20±0.02△△ 0.24±0.02△△C组 9 0.22±0.02△△ 0.21±0.03△△ 0.23±0.02△△D组 9 0.17±0.02△△**●● 0.18±0.01*● 0.21±0.02**●E组 9 0.19±0.01△△●● 0.18±0.02*●● 0.21±0.02**●F组 9 0.17±0.02△△**●● 0.19±0.02● 0.22±0.02*G组 9 0.15±0.01**●● 0.18±0.01*●● 0.21±0.03**●H组 9 0.19±0.02△△● 0.19±0.02△ 0.23±0.01 A组△△

3 讨论

增殖细胞核抗原信使核糖核酸(PCNAmRNA)是合成PCNA的信息基因。PCNA是增殖细胞合成DNA所必需的核蛋白，是真核细胞DNA合成所必需的一种36KD酸性核蛋白。PCNA存在时，DNA多聚酶δ的含量迅速增加，完成增殖细胞核内DNA的合成;缺乏时DNA多聚酶δ失活，增殖细胞不能完成DNA复制，仅能合成类似okazaki的DNA短片段。BcL－2基因属于原位基因，是一种抑制细胞程序性死亡的细胞“存活基因”(SurvivalGene)［2］。乳腺增生病的发生与逐渐加重的过程是上皮细胞增殖过度和凋亡减弱共同作用的结果。BcL－2基因作为细胞凋亡分子机制的重要调控点，成为影响乳腺导管上皮细胞凋亡的重要因素［3］。血管内皮生长因子是一种高效的多功能多肽，最早在培养的肿瘤细胞系中发现。VEGF是重要的血管渗透性因子，它可增加毛细血管和小静脉等微小血管对大分子的通透性。微血管通透性的增加可引起血浆蛋白渗出到血管间隙，外漏的纤维蛋白原凝固成纤维蛋白而沉积，后者作为临时性基质可支持新生血管的生长。综上说明，以上因素与乳腺增生病的发生和发展趋势密切相关。

本实验原位杂交的结果显示，与正常乳腺细胞相比较，乳腺增生细胞中 PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA的阳性表达呈递增趋势，提示在乳腺组织的增生过程中 PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA可能起到重要作用。并且病证结合造模组PCNAmRNA、BcL－2mRNA的阳性表达高于单纯病模型组，提示病证结合造模组大鼠乳腺组织中细胞的增殖更加活跃。实验结果证实，消癖汤不同剂量对乳腺增生大鼠乳腺组织细胞中的 PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA均呈抑制作用，从而推测消癖汤作用机理可能是在细胞的增殖期抑制PCNAmRNA的生成，进而抑制了S期诱导DNA的合成;降低BcL－2mRNA表达，解除BcL－2mRNA对导管上皮细胞正常凋亡机制的抑制，诱导了细胞凋亡的发生;影响VEGFmRNA的活性，抑制腺体新生血管的形成，改善腺体的微循环，逆转乳腺腺体的增生。说明消癖汤治疗肝郁型乳腺增生病具有一定的科学依据。

［1］ 黄旺全.大鼠乳腺增生模型的建立［J］.广东医学，2002，23(4):362－363.

［2］ Tsujimoto Y，Croce CM.Analysis of the structure，transcripts and protein products of bcl－2，the gene involved in human follicular lymphoma［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1986(83):5214.

［3］ 黄志清，阙秀，董建强，等.乳腺肿物Bcl－2表达与激素受体的相关研究［J］.诊断病理学杂志，1997，4(1):25 －27.