过度训练引起的大鼠心肌过氧化损伤与二联苯碘与谷氨酰胺的合并干预作用

董静梅,陈佩杰,刘举科,余志琪

过度训练引起的大鼠心肌过氧化损伤与二联苯碘与谷氨酰胺的合并干预作用

董静梅1.2,陈佩杰2,刘举科1,余志琪1

目的:探寻过度运动引起的心肌过氧化损伤活性氧产生的途径,实施活性氧产生途径上的干预与营养学上的抗氧化防护,为运动引起的心肌过氧化损伤的抗氧化干预提供方法学上的理论支撑;方法:85只雄性waster大鼠,随机分为安静对照组(C)、单纯过度运动组(E)、过度运动给予DPI干预组(D)、过度运动给予谷氨酰胺干预组(G)、过度运动合并给予DPI与谷氨酰胺干预组(DG),建立过度训练模型后的36 h和恢复7天后测定其血浆中的心肌肌钙蛋白(cTn I)、肌酸同工酶(CK-MB)浓度以及心肌组织中的丙二醛(MDA),实时定量PCR测定运动后心肌细胞NADPH氧化酶关键亚基gp91-phox和p22-phox的mRNA的表达;结果:与对照组比较,E组血浆MDA、cTn I、CK-MB均显著升高,恢复7天后显著下降, D、G组则升高幅度低于E组,DG组则变化不明显,但干预组升高的幅度则显著低于单纯训练组。运动后36 h的gp91-phox、p22-phox的mRNA的表达也表现出同样的变化特点;结论:过度训练可引起心肌的过氧化损伤,其中,NADPH氧化酶介导产生的活性氧是其过氧损伤的原因之一,NADPH氧化酶的抑制剂与谷氨酰胺合并时使用具有协同的抗氧化防护作用,可有效地防护过度运动引起的心肌过氧化损伤。

大鼠;过度运动;NADPH氧化酶;活性氧;心肌细胞;过氧化损伤;二联苯碘;谷氨酰胺

长时间大强度运动可引起心肌损伤[20]从而影响运动员的运动能力和身体健康。过度训练(overtraining OT)是指由于持续大负荷运动训练或者训练间歇时间过短而导致机体出现一系列功能紊乱,严重者甚至会出现过度训练综合征(Overtraining Syndroms,OTS)[11],因此,运动引起的心肌损伤的防护在方法学及理论机制方面的研究显得尤为重要。有研究证明,过度训练由于体内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)生成增多而使机体处在氧化胁迫状态导致心肌的过氧化损伤[23],体内活性氧的产生途径众多,目前,较为公认的运动时心肌细胞内源性活性氧产生主要由线粒体电子漏产生[4]。但Kathy等[17](2006)的研究报道认为,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH-oxidse)途径是体内ROS产生的新途径,运动是否能激活心肌NADPH氧化酶?进而产生ROS而导致心肌的过氧化损伤呢?为了验证过度运动是否引起此途径活性氧的产生以及对心肌过氧化损伤进行有效的防护,本实验首先建立大鼠过度运动模型,在此基础上,一方面,设计应用了NADPH氧化酶的特异性抑制剂二联苯碘(Diphenylene iodonium,DPI)来抑制NADPH氧化酶的活性,从而从途径上切断活性氧对大鼠心肌细胞的过氧化损伤;另一方面,通过谷氨酰胺(Glutamine,Gln)的补充从心肌细胞的能量代谢和抗氧化防护中给予干预[5],在检测过度运动后心肌损伤程度的特异性指标心肌肌钙蛋白-I(Cardiac troponin-I,CTn I)和肌酸同工酶(Creatine isoenzyme,CK-MB)及心肌脂质过氧化程度,并利用实时定量PCR检测NADPH氧化酶的关键亚基gp91-phox和p22-Phox的mRNA的表达的变化,探讨过度运动产生的活性氧的新路径以及对心肌损伤的过氧化机制,目的在于从活性氧产生的细胞信号转导通路的途径及来源入手,结合谷氨酰胺相应的抗氧化防护和营养的调配,对运动引起的心肌的抗氧化防护提供一种新思路、新方法。

1 材料和方法

1.1 过度训练模型的建立

分组:85只雄性Vistar大鼠(体重225±6.7g,购自上海BK生物技术有限公司),适应性喂养1周后(环境温度20℃～25℃,每天光照时间保证12 h,自由饮食水)。随机取8只作为安静对照组(C),其余继续进行4周的适应性跑台训练后,随机分为单纯过度训练组(E,n=8)、过度训练DPI干预组(D,n=8)、过度训练谷氨酰胺干预组(G, n=8)、过度训练与DPI合并谷氨酰胺干预组(DG,n=8)。

训练模型:整个训练模型在参照巴西Hohl的方法[14]的基础上(表1),在最后1周的训练时间延长至大鼠力竭,力竭的标准以大鼠四肢无力支持住身体、头部低垂、电刺激后不能继续正常奔跑为力竭标准[21],成功建模的标准以同安静组比较,单纯过度训练组大鼠血浆皮质醇和睾酮在统计学意义上的显著性降低为据[4]。

给药时间及剂量:从第5周开始,D组在训练前0.5 h腹腔注射DPI(Sigma,产品编号:D2926),给予浓度与方法参考[12],G组参考金其贯的方法给予L-谷氨酰胺(Sigma,产品编号:G-3126)进行干预[1],DG组按相同剂量与方法给予DPI与谷氨酰胺干预,同时,E组给予与D、G组相同方法相同剂量的安慰剂(即DPI与Glu的稀释液分别为5%葡萄糖注射液和0.9%生理盐水(上海医药产))。

表1 本研究11周递增负荷的大鼠过度训练方案一览表Table 1 The Protocol of Overtraining Cited by Hohl R

1.2 取材

11周的过度训练模型建立后进行2次取材,第1次取材在末次训练的36～40 h,经过7天同安静组同等环境的休息后进行第2次取材。每次取材均从各组随机取8只大鼠,为避免运动应激和麻醉剂对实验结果的影响,所有大鼠均保证在内眼眶静脉丛取1.5ml血样后立即断头,打开胸腔取出心脏,滤掉心内残存血液,生理盐水冲洗干净,切取心尖右心室壁部分放入-80℃冰箱中,用于mRNA研究及其他心肌丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的测定。其中,所取1 m l血于肝素抗凝管,3 000 r/min×5min离心分离血浆,置-18℃保存用于血浆指标的测定,取0.5m l置于EDTA抗凝管,立即送第二军医大学用于常规生化指标的测试。

2 结果

2.1 过度训练模型建立的指标体系

2.1.1 11周跑台训练结束后,在末次训练的36 h采血测定HB、血浆睾酮、皮质醇等血液指标作为此次建模的指标体系,通过比较对照组与训练组的这些指标的显著性变化来验证大鼠过度训练模型的建立是否成功(表3)。

表3 本研究过度训练建模后36 h训练大鼠血浆中血红蛋白、皮质酮和睾酮的含量变化一览表Table 3 The Changes of Hb,Cortisol, Testosterone in Blood Plasma after 36h Training

2.1.2 11周跑台递增负荷训练过程中大鼠体重的变化

在训练的11周和训练后恢复的1周中,我们对对照组与单纯训练组大鼠体重的变化进行跟踪测定(图1)。

从图1可看出,安静训练组12周的建模过程中,大鼠体重均呈现规律的增长趋势,前5周安静对照组与单纯训练组的大鼠体重基本无差异均呈现一定的增长态势,但进入第5周至第8周前训练组因为运动负荷的加大,大鼠体重显著增长程度降低,而且在进入第8周至11周这个负荷明显加大的过度训练期,训练组大鼠的体重未增反降,在建模后1周的恢复期有所恢复,但与同期安静组对比,训练组大鼠的体重显著低于安静对照组。

图1 本研究11周跑台训练过程中与1周恢复后大鼠体重的变化曲线图Figure. The Weight of Rat during Overtraining and after 7days Recovery

2.2 过度运动后血浆心肌损伤指标的变化

过度运动建模后末次训练的36 h与7天时测定各组大鼠的血浆的心肌cTn I(图2)和CK-MB的变化(图3)。

图2显示,过度运动后36 h,同安静对照C组比较,单纯过度E组、DPI干预D组、谷氨酰胺干预G组及DPI合并谷氨酰胺干预DG组的大鼠血浆心肌cTn I的浓度均有不同程度增加,其中,E组增加幅度最大,D组与G组次之,但3组均达到非常显著性差异水平,而DG组的血浆中cTn I的增加幅度明显低于其他组;通过7天的恢复,大鼠血浆心肌cTn I的浓度各组均有程度不同的下降,但单纯训练E组、D组与安静组比较仍有非常显著性水平,G组达到显著性水平,DG组下降幅度最大与对照组无显著性差异;而干预组与单纯训练组E比较,无论是DPI组、Gln组还是合并干预组DG的大鼠血浆cTn I的浓度均显著低于训练组水平。36 h与恢复7天各组内比较,通过7天恢复后,各组血浆中cTn I的浓度相应的都有所下降,但E组、G组与DG组均达到显著性水平,而D组下降未达到显著性水平。

图2 本研究各组大鼠在过度训练后36 h与恢复1周后血浆cTn I比较示意图Figure 2. The Concertation of cTn I Rat Blood Plasma after Overtraining

图3 本研究各组大鼠在过度训练后36 h与恢复1周后血浆CK-MB浓度的变化比较示意图Fogire 3 The Concertation of CK-MB in Rat Blood Plasma after Overtraining

图3显示,过度运动后36 h,同安静对照C组比较,单纯过度E组、DPI干预D组、谷氨酰胺干预G组及DPI合并谷氨酰胺干预DG组的大鼠血浆CK-MB的浓度也有不同程度增加,其中,E组、D组与G组的增加都达到显著性水平,DG组随有所增加但未达到显著性水平;而干预组与单纯训练组E比较,合并干预组DG的血浆CK-MB的浓度显著低于单纯训练组;7天恢复后与安静对照组比较,只有E组的血浆CK-MB水平仍然较高达到非常显著性水平,D组与G组则达到显著性水平,DG组则基本恢复安静时水平。各组恢复7天时与36 h的血浆CK-MB水平比较发现,D组与G组恢复程度较大达到显著性水平,E组与DG组的恢复则随有所下降但未达到显著性水平。

2.3 过度运动后心肌组织中脂质过氧化水平的变化

图4 本研究各组大鼠在过度训练后36 h与恢复1周后心肌MDA水平的变化示意图Figure 4 The Concertration of MDA in Rat Cardiac Muscle after Overtraining

图4表示,同安静组对照组比较,单纯运动组在过度训练后36 h大鼠心肌MDA水平急剧上升达到了及其显著性水平,D组与G组在运动后36 h随有所升高但无统计学意义,DG组则有所下降也未达到显著性水平;而干预组与单纯训练组E比较,无论是DPI组、Gln组还是合并干预组的心肌MDA的浓度均程度不一的低于单纯训练组。恢复7天后与36 h的心肌MDA对照均有程度不一的恢复下降,但只有训练组达到非常显著性水平。

2.4 过度运动后大鼠心肌细胞NADPH氧化酶的亚基gp91-phox和p22-phox的mRNA表达

为了更进一步对过度运动心肌细胞所引起的运动损伤机制的探讨,我们应用了实时定量PCR技术,对过度运动后影响ROS产生的NADPH氧化酶的关键亚基gp91-phox和p22-Phox的mRNA的表达进行实时定量测定。

通过对大鼠过度训练后36h的心肌细胞NADPH氧化酶的关键亚基gp91-phox和p22-phox的mRNA的表达的实时定量测定结果表明(图5、图6):过度运动后E组的gp91-phox和p22-phox的mRNA表达均上调并达到了非常显著性水平,其他各组均的gp91-phox和p22-phox的mRNA表达的上调均未达到显著性变化,而与单纯训练组比较,则DPI干预组与合并干预组gp91-phox和p22-phox的mRNA表达均显著性下调,谷氨酰胺组的gp91-phox的mRNA表达也显著下调,但p22-phox的mRNA表达无显著变化。

3 分析与讨论

3.1 过度训练模型的指标体系成功建立

过度运动模型的建立是整个实验成败的关键之处,本实验在参考过度运动模型建立的基础上,延长最后一周的训练时间为大鼠力竭,参考文献[23]以大鼠体重、一般情况、运动能力等进行过度的监测,辅以血浆皮质酮和睾酮以及血红蛋白等指标建立这样的指标体系协助判断动物过度模型的成功建立。该实验的指标体系表明:训练组与安静对照组的皮质酮、睾酮、血红蛋白及体重的变化显著性差异中确认本次过度实验模型成功建立。

图5 本研究过度训练后各组大鼠心肌NADPH氧化酶gp91-phox的m RNA表达变化示意图Figure 5 The Expression of gp91-phox mRNA in Rat Cardiac Muscle after Overtaining

图6 本研究过度训练后各组大鼠心肌NADPH氧化酶p22-phox的m RNA表达变化示意图Figure 6 The Expression of p22-phox mRNA in Rat Cardiac Muscle afterOvertaining

3.2 心肌损伤的程度与机体过氧化程度的的量化

肌酸激酶同工酶(CK-MB)是由M和B亚基构成的杂化型二聚体,主要存在于心肌细胞的外浆层,是心肌酶谱中的特异性酶,一度被认为是诊断心肌损伤特别是急性心肌梗死(AM I)的“金标准”而广泛应用,CK-MB在心肌损伤30h达到高峰,本研究在建模末次训练的36～40 h内取样能较好地体现过度运动对大鼠心肌损伤的最高程度,且该酶的出现时间较传统酶学指标要早,特异性和敏感度也相对要高,但CK-MB作为心肌损伤检测的标志酶,尚有不足之处。当心肌缺血或发生微小梗死时,CK-MB常不增高,由此可见,CK-MB对于心肌微小损伤不能检出[7]。心肌肌钙蛋白(cTn)在心肌细胞有微小损伤时,cTn就有明显升高,因此,可用于微小心肌损伤(MMD)的诊断,使其成为一种新的诊断心肌缺血坏死的血浆学指标,而其在血浆中出现早,持续时间长,是一种高特异、高灵敏度的反映心肌损伤的血浆蛋白质,在心肌细胞完整状态下,cTn I约3%游离在血浆内,其余同心肌结构蛋白相结合,当心肌损伤时,游离于胞浆中的cTn I快速释放入外周血循环,血浆水平于3～5 h升高,其后肌原纤维不断崩解破坏,cT-n I不断释放,cTn I血浆水平在24 h达到峰值,4～10天恢复到正常水平[3]。发生心肌梗死病人在发病后2～4 h后血液中cTn I和中cTnT出现升高现象并持续到21d[18]。目前,关于运动尤其是大强度长时间的运动可引起血液中cTn I和中cTnT升高的报道很多,但不管是人体或动物实验的研究结果都显示:运动后血液中cTn I和中cTnT升高的现象在运动后24～48 h后消失[24]。因此,本实验在大鼠过度训练后7天的血浆cTn I的浓度仍没有恢复到训练前水平值得深思。Hesse在研究报告称,只有在心肌不可逆损伤的初期,由于心肌代谢功能的抑制而引起心肌cTn I的释放的下调,而一旦进入不可逆损伤期,肌原纤维崩解破坏心肌释放cTn I大幅增加,恢复时间就会延长[13]。据此推测,本实验建立的大鼠过度训练模型是在过度训练的基础上再合并力竭训练,该模型运动恢复的时间短,运动频率高,运动负荷过大是否对大鼠心肌的损伤有可能是一种不可逆损伤?由于目前对于运动引起的可逆性损伤与不可逆损伤的临界血液学指标的浓度还没有相关的研究报道,其损伤的程度和运动的强度以及时间及负荷的依从关系有待通过反映心肌损伤的血液指标与细胞形态学特点的合并应用进行进一步的研究。

心肌MDA是反映心肌细胞总体脂质过氧化的水平,是心肌细胞在过度运动的诱导下多种途径产生ROS的终极代谢产物,而机体异常ROS的表达可与心肌细胞成分,如膜磷脂、蛋白质、核酸等发生交联反应,造成心肌细胞结构损伤和功能性代谢障碍。已有研究表明,ROS与心肌缺血与坏死、心肌顿抑、心功能衰竭等密切相关[8,10,19]。本实验单纯训练组在过度训练后36h心肌MDA水平急剧上升,表现出与CK-MB与cTn I的变化与MDA变化一定的相关性,说明过度运动引起心肌细胞的过氧化而导致心肌损伤。但7d后心肌MDA的水平有低于训练前的趋势,其原因为运动训练使机体氧化与抗氧化系统的一种适应,与此前有关此方面的报道一致[22]。

3.3 DPI与Gln对过度训练心肌损伤的协同干预作用

运动时ROS产生的增加导致心肌的过氧化损伤已经是一个不争的事实。但心肌活性氧的产生途径众多,其中,NADPH氧化酶途径是心肌细胞产生ROS的途径之一,NADPH氧化酶是细胞线粒体呼吸过程中催化NADPH递氢离子给氧的还原性酶,NADPY氧化酶及其家族NOX是公认的能够调节ROS产生的特殊功能酶。目前已被发现在包括有吞噬细胞,血管内皮细胞及心肌细胞等多个组织细胞中有表达,由其介导产生的适度的ROS现已证明不再是有氧代谢的副产物,而是具有信号转导、免疫功能、激素生物合成功能的活性产物,但过多的ROS的产生可以导致脂质过氧化物的产生而是细胞DNA交联断裂,细胞凋亡性细胞损伤。有研究证实,在心肌肥大和心衰病人中,心肌的NADPH氧化酶的表达和活性升高[15]。那么,运动时心肌ROS的活性氧的产生是否与运动导致NADPH氧化酶的激活关联呢?如果关联,该路径ROS产生的抑制不妨为降低心肌氧化损伤的有效措施。Engberding等[8](2004)的研究就是针对心梗时黄嘌呤ROS产生途径的黄嘌呤氧化酶(XO)表达显著增多,而联用XO阻滞剂与别嘌呤醇减少心肌ROS的产生,适应于左室重建,从而改善心梗后心功能。因此,对于NADPH氧化酶的抑制剂DPI的使用也是基于此方面的思考。同时,Gln是一种非必需氨基酸,参与体内许多重要的代谢过程,是一种重要的氮源运载工具,也是体内多种细胞的重要能源来源之一。近年来,补充Gln在动物实验中和临床研究表明:缺血再灌注损伤由于氧自由基大量增加,攻击细胞膜致其脂质过氧化,细胞膜性结构受损,引起细胞代谢及功能障碍,甚至导致细胞的凋亡或坏死[2,9]。因此,本实验设计采用了DPI与Gln两种干预措施的单个和合并的应用,其中, DPI是NADPH氧化酶的特异性抑制剂,抑制NADPH递氢给氧气产生ROS,因此,从ROS的产生途径来抑制该酶的活性从而降低活性氧的产生。本实验数据表明,DPI干预组与Gln干预组均可降低过度运动引起的心肌的CKMB与cTnl的水平,从而降低心肌的氧化损伤。实验结果十分明显地表示:DPI干预组与Gln干预的合并干预并无拮抗作用,而可显著降低血浆cTn I的水平而有效地降低运动引起的心肌微小损伤。

3.4 过度运动使心肌细胞NADPH氧化酶关键亚基的基因表达上调而激活NADPH氧化酶产生ROS

为了更进一步确定运动对NADPH氧化酶活性的影响,验证过度运动导致的心肌过氧化损伤是由于运动诱导心肌细胞NADPH氧化酶介导产生ROS途径所致,本实验采用实时定量PCR技术测定过度运动后心肌细胞的亚基gp91-phox和p22-phox的mRNA表达。分别与安静组与单纯训练组比较的结果表明,DPI可显著抑制NADPH氧化酶的活性,Gln的干预对NADPH氧化酶的活性有微弱影响,其机制尚不确定,但DPI与Gln两者合并使用并没有拮抗抑制NADPH氧化酶活性,干预组和合并干预组各组NADPH氧化酶的活性与定量心肌损伤指标以及脂质过氧化水平各组的变化基本关联,而且,表现出DPI与Gln合并使用协同抗氧化的能力。其原因在于,一方面,DPI抑制了NADPH氧化酶的活性;另一方面,Gln作为还原型谷胱苷肽的前体物质与合成嘌呤和嘧啶碱的能源物质形成强抗氧化作用。

4 小结

过度运动可引起心肌细胞内NADPH氧化酶关键亚基的mRAN基因表达上调从而激活NADPH氧化酶途径产生ROS,导致心肌ROS的产生增加,使心肌产生过氧化胁迫状态而导致心肌损伤。所以,可以肯定的是,运动诱导NADPH氧化酶介导产生ROS是心肌过氧化损伤的途径之一,因此,在此途径上对NADPH氧化酶抑制剂DPI的使用可以有效地抑制NADPH氧化酶的活性从而降低ROS的产生。Gln单一的使用可干预心肌缺血性氧自由基增多,也具有抗氧化保护心肌损伤的作用,两者合并使用并无功能上的拮抗作用,而是具有协同的抗氧化防护作用,所以,NADPH氧化剂的使用与谷氨酰胺的合并使用可从ROS的产生途径和抗氧化剂的能量供应两方面来有效降低运动引起的心肌过氧化损伤。

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The Oxidative Damage and in Rat M yocardial Cells Induced by Exhaustive Exercise and the Intervention of DPIand Glutam inate

DONG Jing-mei1,2,CHEN Pei-jie2,L IU Ju-ke1,YU Zhi-qi1

Objective:To exp lo re the pathways of reactive oxygen species(ROS)induced by exhaustive exercise that damage myocardial cell and to put anti-oxidant intervention into p ractice w ith the combination both the way of generating ROS and the nutrition.Methods:85 male Wistar rats were random ly divided into five groups and established p ro tocol of exhaustive exercise.The five groups is sedentary control group(C),exhaustive exercise group(E),exhaustive exercise and DPI intervention group(D),exhaustive exercise and glutamine intervention group(G),exhaustive exercise and the combination of DPI and glutamine intervention group (DG).The concentration ofmalondialdehyde(MDA),cardiac troponin T(c Tn T),creatine isoenzyme(CK-MB)in rat blood p lasma were determined at 36-40 hours after exhaustive exercise and 7 days recovery respectively.The exp ression of FAS/FASL of m RNA and the NADPH oxidase subunit gp91-phox p22-phox of m RNA in cardiac myocyte were detected w ith real-time quantitative PCR.Results:Compared w ith control group C,the concentration of MDA,c Tn I,CK-MB in E group were increased significantly after 7 days recovery were decreased significantly and the concentration in group D and group G also increased no significantly and in DG group did no t change.The exp ression of the FAS/FASL,gp91-phox,p22-Phox of m RNA also showed the same results as the plasma index in all groups at 36h after exercise.Conclusion:The exhaustive training can cause excessive oxidative damage in the heart muscle.The one pathway of ROS generated by NADPH oxidase is the one reasons of the peroxide injury of myocardial cell.So the combination intervention w ith the inhibitors of NADPH oxidase and glutamine supplement can p rotect the oxidative injury in myocardial cell induced by exhaustive exercise effectively.

rat;exhaustive exercise;NAD PH oxidase;reactive oxygen species;m yocardial cells;oxidative injury;FAS/FASL;D PI;glutam ine

G804.7

A

2010-07-05;

2010-11-10

甘肃省自然科学基金资助项目(0803RJZA 083)。

董静梅(1969-),女,甘肃庆阳人,副教授,在读博士研究生,主要研究方向为运动与健康促进学,Tel:(021) 35080378,E-mail:Lzdjm119@sohu.com。

1.兰州城市学院体育学院,甘肃兰州730070;2.上海体育学院运动科学学院,上海200438 1.Lanzhou City University,Lanzhou 730070,China; 2.Shanghai University of Sport,Shanghai 200438,China.

1.3 血浆指标及心肌组织中丙二醛的测定

血浆指标包括皮质酮和睾酮及心肌肌钙蛋白(c Tn I)、肌酸同工酶(CK-MB)以及心肌组织中的丙二醛(MDA)均采用酶联免疫法测定,其中,MDA试剂盒由南京建成生物制品研究所提供外,其他EL ISA试剂盒均购自美国R&D Systems公司。

1.4 NADPH氧化酶亚基gp91-phox和p22-phox的mRNA表达实时定量测定

1.4.1 心肌总RNA的提取与逆转录cDNA合成

取冻存心肌组织置于玻璃匀浆器中,加入1 ml Trizol液匀浆充分,按照TRIzol RNA提取试剂盒操作说明(GIBCO BRL公司)要求的顺序和剂量加入反应物,在吸光度为260 nm紫外分光光度计(Unico UV-2000型)测定RNA浓度后加入2 ugRNA在20μl反应体系中反转录合成cDNA (逆转录试剂盒购自MBI公司)于-20℃冻存备用。

1.4.2 实时定量PCR检测

序列参照Gene Bank数据库中各目的基因的序列,引物由ABI公司的Primer Exp ress Software v2.0设计,由Invitrigen公司合成gp91-phox、p22-phox以及内参GAPDH的序列位置(表2)。

PCR扩增:25μL体系:其中,10×PCR Buffer 2.5μl,灭菌蒸馏水15.1μl,TaKaRa 2μl,Taq HS 0.3μl,上下游引物各0.3μl,逆转录产物2μl,sybr染料0.5μl.反应条件是:(95℃2 min)1 cycle;(94℃10 s,61℃10 s,72℃40s)40 cycles.61℃退火。定量PCR检测在Rotor-Gene RG 3000型(Corbett,Aust ralia)PCR仪上进行。结果用绝对定量的基因表达的拷贝数表示,并用GAPDH对结果进行校正。

表2 本研究gp91-phox、p22-phox与GAPDH的基因序列及PCR引物设计一览表
Table 2 The Forward of gp91-phox、p22-phox and GAPDH

Primer Sequence(5’-3’)Sequence Number gp91phox Forward Reverse TGACTTGGAAA TGGA TCGTGG CGCCAACAA TGCGGA TA TGTG AJ295950.1 p22-phox Forward Reverse TTGCAGGAGTGCTCA TCTGTC GTTGGTAGGTGGCTGCTTGA T NM_024160.1 GAPDH Forward Reverse ACCACAGTCCA TGCCA TCAC TCCACCACCCTGTTGCTGTA NM_017008

1.5 统计方法

所有测试结果以平均数±标准差表示(±SD),用SPSS for Window s 13.0软件分析处理,进行单因素方差分析(One-way AVOVA),P<0.05为具有显著性意义,P< 0.01为具有非常显著性意义。

1000-677X(2010)12-0076-06