正交设计法优选浙贝母总＊生物碱提取分离工艺

周 欢,李敬芬,戚肆朝,徐纯夏,宋国鑫,余腾飞,刘建华

(湖州师范学院生命科学学院,浙江湖州313000)

正交设计法优选浙贝母总＊生物碱提取分离工艺

周 欢,李敬芬,戚肆朝,徐纯夏,宋国鑫,余腾飞,刘建华

(湖州师范学院生命科学学院,浙江湖州313000)

为了优化浙贝母中生物碱提取条件,比较了影响生物碱提取率诸因素,并利用数理统计学中的正交试验法优化提取条件.实验结果表明,用浙贝母粉末重量30倍的55%乙醇(W/V)为提取溶剂,结合摇床振荡法,振荡速度为150r/min,提取24h,经氯仿萃取,生物碱的提取率最高.用D1300大孔树脂,95%乙醇溶液作为洗脱剂,上样p H为9.0,原液浓度为0.1mol/L时为最佳纯化条件.本试验筛选提取方法可作为贝母中生物碱提取的一种较好选择.

浙贝母;生物碱;提取;纯化

0 引言

浙贝母为百合科贝母属浙贝母(Fritillaria thunbergii M iq.)干燥鳞茎,其主要活性成分为生物碱,含浙贝甲素、浙贝乙素、贝母辛、贝母酚等[1].据李萍等[2]研究,浙贝母总生物碱对小鼠氨水引咳有镇咳作用.钱伯初等[3]证实浙贝母碱和去氢浙贝母碱为浙贝母镇咳有效成分.

用大孔树脂纯化生物碱可避免引入杂质[4].如用大孔树脂提取喜树碱可得到含约50%的产品,重结晶后含量可达90%[5],表明这是一种有效的分离方法.

目前,浙贝母总生物碱纯化工艺和质量控制及活性研究方面有待改进,本试验拟通过正交实验[6,7],以总生物碱保留率和纯度为参数,用大孔吸附树脂对浙贝母总生物碱提取分离工艺进行研究,选出浙贝母生物碱分离纯化最佳工艺,为实现浙贝母总生物碱工业化大生产及其质量控制,为申报生物碱为主要药效物质的新药,促进浙贝母总生物碱深入研究奠定基础.

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV-1800PC型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)、DZG-6050型真空干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)、FZ102微型植物粉碎机、RE-52A旋转蒸发仪(上海青浦沪西仪器厂).

1.2 材料

浙贝母(购自杭州中药饮片厂)、D101大孔吸附树脂(国药集团化学试剂有限公司)、LD605型树脂(国药集团化学试剂有限公司)、D1300大孔树脂(国药集团化学试剂有限公司).氯仿、95%乙醇、盐酸、浓氨水、碘化铋钾试剂等均为分析纯.标准对照品:浙贝甲素(购自浙江省药品检验所).

2 实验步骤

2.1 总生物碱提取工艺优化研究

2.1.1 标准曲线绘制

取10mg浙贝甲素标准品于10m L氯仿配成母液,用母液制成含浙贝甲素0～120Λg标准品溶液,以20Λg为一梯度.用100Conc紫外分光光度计,波长618.0 nm测吸光度(A).最小二乘法得回归方程:A= 0.087 8C-0.074 3(R=0.999 6).

2.1.2 生物碱提取与测定

将直径3～6cm的浙贝母鲜球茎置烘箱,于80℃烘24h,再用FW 2100型高速万能粉碎机研成粉末.称1g浙贝母粗粉2份,分别置100m L锥形瓶中,并各加入40m L 95%乙醇,分别于室温冷浸和摇床振荡提48h,得粗提液,用中速定性滤纸过滤,滤液用旋转蒸发仪减压浓缩,醇提物用2%盐酸溶解,过滤,滤液用浓氨水调节p H至11,再用氯仿萃取4次,每次20m L,萃取液经减压浓缩称取浸膏重.再用氯仿定容至1m L,用分光光度计测吸光度,按标准曲线得回归方程算生物碱含量.

2.1.3 正交试验设计

拟定4个因素,每个因素3个水平,按L9(34)正交设计表(见表1)确定方案,找出的最优生物碱提取组见表2.

表1 因素水平表

表2 正交试验结果表

2.2 浙贝母总生物碱的纯化工艺

2.2.1 树脂处理

3种型号大孔吸附树脂用95%乙醇浸泡24h,湿法装柱,95%乙醇冲洗树脂至流出液与水(1∶5)混合无混浊,用水冲洗至流出液无醇味并排除气泡备用.

2.2.2 上样液制备及预处理

取浙贝母粗粉,照最佳工艺条件提取,提取液用适当方法除杂,为上样液.

2.2.3 实验步骤

取50 m L浙贝母试样,依表4,用5%NaOH溶液调p H,以2 mL/min流速吸附,再用8 m L蒸馏水以同样的流速冲洗树脂至流出液无色.再用低浓度乙醇以2 mL/min流速进行解吸附洗脱,用95%乙醇洗脱,以改良碘化铋钾试剂检测终点.收集95%乙醇洗脱液,减压浓缩,60°C真空干燥至恒重,精密称重,并依下面的方法测总生物碱质量,计算保留率和生物碱含量.

2.2.4 正交实验设计

影响贝母总生物碱在大孔吸附树脂上吸附与洗脱的主要因素有:上样p H、吸附树脂类型、原液浓度及洗脱剂对吸附影响,见表3、表4.

表3 大孔吸附树脂上吸附洗脱的正交因素水平表

表4 大孔吸附树脂上吸附洗脱的正交实验表

保留率=样品中总生物碱含量(g)/湖北贝母药材中总生物碱重量(g).

样品中总生物碱含量=样品中总生物碱质量(g)/样品重量(g).

3 实验结果与分析

3.1 总生物碱提取工艺优化研究

我们对总生物碱的两种提取法进行了实验比较,指标是浸膏量和生物碱含量,以便筛选出较好的提取方法.实验结果见表5.

表5 不同提取方法比较

据表5,采用摇床振荡法提取的生物碱含量较高,故正交试验采用该方法进行提取.

正交试验分析结果见表2,从表2可以看出,提取率最高为A3B3C3D3,因素影响主次为B、C、A、D.分析知,用摇床震荡浸提,转速150r/min,30倍量55%乙醇提取8次,每次72h为最佳提取.

3.2 浙贝母总生物碱的纯化工艺研究

从产品总生物碱含量结果分析,最佳工艺条件是A2B2C2D3.四因素对实验影响大小为C>D>B>A.从产品总生物碱保留率结果分析,最佳工艺条件是A2B2C2D2.四因素对实验影响大小为A>B>C>D.

鉴于上样p H值、吸附树脂类型、原液浓度、洗脱剂对产品总生物碱保留率均无显著性影响,故主要考察各因素对产品中总生物碱含量的影响,最终确定最佳工艺组合为A2B2C2D3,即选上样p H值为9,吸附树脂类型为D1300大孔树脂,原液浓度为0.1mo l/L,洗脱剂为95%乙醇.

[1]张建兴,劳爱娜,徐任生.浙贝母新鲜鳞茎化学成分的研究[J].中国中药杂志,1993,18(6):354～355,382.

[2]李萍,季晖,徐国钧,等.贝母类中药的镇咳祛痰作用研究[J].中国药科大学学报,1993,20(6):360～362.

[3]钱伯初,许衡钧.浙贝碱和去氢浙贝碱的镇咳镇静作用[J].药学学报,1985,20(4):306～308.

[4]张红,童明容,潘继伦,等.大孔吸附树脂提取喜树碱的研究[J].离子交换与吸附,1995,8(2):145～150.

[5]罗集鹏,马红文,许敏青,等.大孔树脂用于小檗碱的富集与定量分析[J].中药材,2000,21(7):413～415.

[6]何惟胜.试论中药制剂工艺优化的实验设计[J].基层中药杂志,2001,29(2):46～48.

[7]丁春霞,屠善军,应敏.浙贝母中生物碱提取方法以及条件的优化[J].现代中药研究与实践,2004,18(2):28～30.

Abstract:To op timize the condition for extraction of alkaloids in f ritillaria thunbergiimiq.,we have investigated several possible facto rs affecting the rate of extract ion of alkaloids in fritillaria thunbergiim iq and use the orthogonal design method to op timize the condition.Our results show that the highest rate of extraction of alkaloidswasobtained by using 55%ethanol thirty times versus samp le(v/w),in combination of gyratory shaker,and ethyl acetate.With D1300macroporous resin,95%ethanol solution aseluting agent,the kind of p H 9.0,stock solution concentration of 0.1 as the best purification conditions. Thismethod is a good and alternative choice in the extraction of alkaloids.

Key words:fritillaria thunbergiimiq.;alkaloid;extraction;purification

The Orthogonal Design Method of Optimal Fritillaria Thunbergii M iq.Total Alkaloid Extraction Separation Process

ZHOU Huan,L IJing-fen,Q ISi-chao,XU Chun-xia,SONG Guo-xin,YU Teng-fei
(Faculty of Life Science,Huzhou Teachers College,Huzhou 313000,China)

R284.2

A

1009-1734(2010)02-0056-04

2010-02-20

浙江省教育厅科研项目(20070487);2010年浙江省新苗人才计划(BZ04001).

周欢,湖州师范学院生命科学学院2008级本科生,从事天然有效成分提取研究.