实验性脑出血大鼠急性期脑组织含水量与ET、NO含量的关系

刘文立,张生林

脑出血是急性脑血管疾病的危重类型,其发生率、致残率和病死率均较高。脑出血后脑水肿形成是脑出血的重要并发症,也是临床脑出血病人病情加重和死亡的主要原因之一,但脑出血后脑水肿形成的病理机制至今尚未完全阐明。内皮素(endothelin,ET)和一氧化氮(nitric oxide,NO)是近年来发现的血管活性物质,两者在脑血流调节中起重要作用[1]。本实验旨在通过建立大鼠脑出血模型,观察脑出血后血肿周围脑组织含水量与ET、NO含量之间的关系,探讨ET、NO在脑出血后脑水肿形成中的作用,为临床治疗提供新的理论依据和方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选用健康雄性SD大鼠48只,体重250 g～300 g,由山西医科大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为脑出血组和假手术对照组,每组24只,两组动物再随机分为术后1 d,3 d,5,7 d 4个时间点,每个时间点6只,分别用于测定脑组织含水量与ET、NO含量。

1.2 动物模型制备 采用Rosenberg等报道的方法,将大鼠用20%乌拉坦(0.35 mg/100 g)腹腔注射麻醉,固定于立体定向仪(江湾I型)上。头皮下正中切口约1.0 cm,于颅骨背侧前囟后1.0 mm,右侧旁开3.0 mm处钻孔,用微量注射器沿钻孔垂直进针约5.8 mm。脑出血组在右侧尾状核注射溶有Ⅶ型胶原酶(0.5 U/2 μ L)的生理盐水2μL,2 min内注射完毕,留针5 min。Ⅶ型胶原酶由美国Sigma公司提供。对照组在右侧尾状核注入2 μ L生理盐水,然后缝合头皮。术后观察神经系统症状,大鼠出现病灶对侧偏瘫、行走时有不同程度的旋转、患侧前肢内收及后肢外展,视为模型成功[2]。

1.3 脑组织样本的采取 按各组预定时间过量麻醉处死大鼠,开颅取脑。脑出血组将脑血肿所在的右侧大脑沿血肿正中冠状切面切开,取血肿前部脑组织200 mg做脑含水量测定,取血肿后内脑组织约200 mg测定NO含量,取血肿后外脑组织约100 mg测定ET含量。对照组取右侧大脑按上述方法进行操作。

1.4 脑组织含水量的测定 用干湿重法测定脑组织含水量。脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%[3]。

1.5 脑组织ET含量的测定 采用放射免疫分析法测定ET,试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免研究所。

1.6 脑组织NO含量的测定 采用硝酸还原酶法测定NO,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

2 结 果

2.1 脑组织ET、NO含量及脑含水量变化 脑出血组各时间点脑组织ET、NO含量及脑含水量均高于假手术对照组(P＜0.05或 P＜0.01)。脑出血组脑组织ET、NO含量及脑含水量均于1 d升高,3 d达高峰,5 d下降(P＜0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠脑组织ET、NO含量及脑含水量(±s)

表1 各组大鼠脑组织ET、NO含量及脑含水量(±s)

组别 动物数只ET pg/mL NO μ mol/mgpr含水量%脑出血组 1 d 6 99.42±3.452) 4.40±1.462)80.23±1.212)3 d 6 106.23±4.792) 6.64±1.392)82.00±1.452)5 d 6 94.43±1.942) 2.87±1.181)78.53±0.812)7 d 6 93.50±2.111) 2.70±0.791)77.86±1.071)假手术组 1 d 6 92.58±2.61 2.26±0.65 77.01±1.02 3 d 6 91.82±2.03 2.03±0.35 76.41±1.02 5 d 6 91.23±1.39 1.56±0.76 75.83±1.50 7 d 6 90.71±1.39 1.54±0.66 75.61±1.69与假手术组比较,1)P＜0.05,2)P＜0.01

2.2 脑组织含水量与ET、NO含量的关系 经相关分析,结果显示脑出血大鼠急性期脑组织含水量与ET、NO含量均呈正相关关系(P＜0.05或P＜0.01)。详见表 2。

表2 脑出血大鼠急性期脑组织含水量与ET、NO含量相关分析

3 讨 论

3.1 脑出血后脑水肿与ET的关系 ET是一种由21个氨基酸组成的血管活性多肽,是目前所知作用最强的长效血管收缩剂[4]。ET不仅存在于神经系统的一些内皮细胞中,也广泛分布于神经细胞内[5]。已证实神经胶质细胞也产生ET,并以旁分泌的方式对神经胶质细胞和神经元发挥作用,证明ET可能为一种潜在的神经调节因子,并具有强大的缩血管作用[6]。刘爱芬等[7]测定观察了57例脑出血患者血浆ET含量的变化,结果发现脑出血后24 h内血浆ET水平即开始升高,1 d～3 d达高峰,之后维持在较高水平直至14 d,半月后开始下降,1月后基本降至正常水平。这与脑出血后脑水肿的形成时程一致。张微微等[8]报道大鼠脑出血后脑内ET-1的表达与脑水含量的变化规律基本一致。陈红霞等[9]报道急性脑出血患者在出血后第1天、第4天的血浆内皮素含量明显高于对照组。

本研究结果显示大鼠脑出血后,血肿周围脑组织含水量与ET含量均于1 d时升高,3 d时达高峰,5 d降低,7 d与5 d差别不显著,脑组织含水量与ET含量呈正相关关系。表明ET参与了脑出血后脑水肿的发生、发展。脑出血后ET升高可能与下列因素有关:应激状态下儿茶酚胺大量生成诱导ET过量合成。脑出血时,红细胞破坏释放氧合血红蛋白(HbO2),刺激血管内皮细胞产生ET,还可能通过抑制cGMP或cAMP促进ET释放增多[10]。局部因素如肾上腺素、凝血酶增多等加速ET合成。脑出血时,颅内压增高,灌注压降低,缺血缺氧使ET合成、释放增多[11]。脑出血后内皮素过量合成,通过ET受体诱导细胞内Ca2+超载,血管收缩,细胞水肿;此外,内皮素分泌增多,调控Na+-H+交换,促进Na+内流,使细胞内 Na+浓度增高[12];内皮素还激活磷脂酶A2产生花生四烯酸,后者及其代谢产物可引起毛细血管通透性升高。因此,ET促进了脑出血后脑水肿的发生及发展。

3.2 脑出血后脑水肿与NO的关系 NO在体内扮演着生理和病理的双重角色,它产生异常与临床多种疾病的发生发展有密切关系。脑内NO既可起脑保护作用,又可起神经细胞毒性作用[13]。NO是由 L-精氨酸在NO合酶(NOS)催化下生成的。生理量的NO可扩张血管,改善微循环及抗血小板凝聚等,但NO产生过多则会损害神经原,产生病理效应。王永志等[14]通过临床研究报道,脑出血急性期血清NO水平较恢复期明显升高,稳定期血清NO水平仍高于对照组,恢复期接近正常水平。这与脑出血后脑水肿的变化规律基本一致。Chen等[15]报道,通过检测351例脑出血患者急性期血浆NO值及100例健康成人血浆NO值,结果发现,脑出血患者急性期血浆NO均值较健康成人血浆NO均值显著升高。杨文清等[16]报道,大鼠脑出血后4 h脑组织中NO含量增加,72 h达到高峰。

本研究发现,大鼠脑出血后血肿周围脑组织含水量与NO含量均于1 d时升高,3 d时达高峰,5 d降低,7 d与5 d差别不显著,脑组织含水量与NO含量呈正相关关系。说明NO参与了脑出血后脑水肿的发生、发展。脑出血后NO升高的原因可能是,脑出血时脑细胞释放大量谷氨酸;激活了N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体,促进Ca2+大量内流并与CaM结合,从而激活了 Ca2+依赖性cNOS,产生大量的 NO[17];同时,出血灶周围大量白细胞浸润和聚集,激活了iNOS,从而导致NO的大量产生。高浓度的NO可与周围的超氧阴离子(O2-)迅速反应,生成另一具有强氧化作用的自由基-过氧亚硝基阴离子(ONOO-)而产生细胞毒性作用[18-20]。ONOO-可有效地氧化蛋白质疏基、Fe/s中心、锌指结构、硝基化蛋白质的酪氨酸残基,使许多重要的蛋白质或酶失活,影响细胞代谢,并抑制呼吸链酶,破坏线粒体结构,使DNA断裂,并可启动脂质过氧化[21],导致大脑微血管内皮细胞坏死,通透性增强,脑水肿形成。

脑出血后脑组织内ET和NO含量均升高,且与脑水肿程度呈正相关关系。ET和NO参与了脑出血后脑水肿的发生及发展。这为今后脑出血患者的治疗提供了一定的理论根据。可否应用ET受体拮抗剂和适量应用NOS抑制剂治疗急性脑出血,有待于进一步研究。

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