比索洛尔与阿托伐他汀对高血压大鼠心肌纤维化影响的实验研究

李元珍,李 征,李茹香

心肌纤维化是多种心血管疾病(如高血压、心肌梗死、心力衰竭、心律失常、猝死等)发展到一定阶段的共同病理改变,因此,防止和逆转心肌纤维化已成为治疗心血管疾病的主要目的。β受体阻滞剂与他汀类药物已广泛应用于临床。本研究以肾性高血压大鼠为模型,观察在使用高选择性β1受体阻滞剂比索洛尔的基础上加用阿托伐他汀对高血压心肌纤维化的影响,并探讨其逆转心肌纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1 一般材料 雄性Wistar大鼠24只(购于山西医科大学生理教研室,体重180 g～230 g),将其随机分为3组,比索洛尔组、阿托伐他汀组、比索洛尔+阿托伐他汀组。用10%的水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔麻醉,开腹,用内径0.25 mm的银夹钳夹3组大鼠左侧肾动脉使其部分狭窄,术后4周测尾动脉收缩压,高于20 kpa者为高血压模型制备成功。比索洛尔组用蒸馏水(1 mL)溶解的比索洛尔[(2 mg/(kg◦d)],阿托伐他汀组用蒸馏水(1 mL)溶解的阿托伐他汀灌胃[50 mg/(kg◦d)],联合用药组同时使用上述两种药物,连续观察8周。

1.2 标本采集与处理 术后12周末,用20%乌拉坦(4 mL/kg)麻醉大鼠,开胸取出心脏,以冰生理盐水冲洗干净,吸干水分,去除大血管、左右心房、右心室,取左心室并称其重量即左心室重量(LVM)除以体重(BW)得到左室重量指数(LVMI)。将左室心肌标本横切分为两份,中下段部分冻存与-70℃冰箱中,另取左室中上断横切面组织一块,经10%甲醛固定 24 h,常规脱水,石蜡包埋,制成 4 μ m切片,分别行心肌 VG染色,及MMP-9的免疫组化染色。

1.3 心肌羟脯氨酸(HC)浓度的测量 羟脯氨酸是胶原蛋白的主要成分,而且动物组织中的羟脯氨酸几乎完全来自胶原,因此,心肌组织内羟脯氨酸的含量可以代表胶原的水平,即反映心肌纤维化的程度。按试剂说明书,100 mg心肌组织匀浆、消化、水解、取上清,使用分光光度计在550 nm处测各管吸光度。羟脯氨酸浓度=[(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)]×标准管含量(5 μ g/mL)×[水解液总体积(10 mL)/组织湿重(mg)]。

1.4 心肌胶原纤维的半定量分析 组织切片进行苦味酸-酸性品红(VG)胶原染色,利用图像分析系统,测量心肌胶原灰度值(反映组织化学染色产物深浅程度,灰度值越大,则反应产物浓度越小,反之,产物浓度越大)。测量心肌胶原容积分数(CVF),CVF=胶原面积/总面积。每张切片随机取(4～6)个视野取其平均值。

1.5 基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达水平测定 MM P-9采用SP三步法免疫组化染色,一抗为羊多抗IgG(购于北京中衫金桥有限公司),二抗为SPABC试剂盒(购于北京中衫金桥有限公司),按试剂盒说明书操作,利用图像分析系统进行分析,测量其灰度值,每张切片平均选取(4～6)个视野。

2 结 果

2.1 各组大鼠血压、LVMI、HC及CVF结果(见表1) 与治疗前相比,比索洛尔组及联合用药组治疗后大鼠血压明显降低(P＜0.05),而阿托伐他汀组血压略有下降,但治疗前后相比无统计学意义(P＞0.05)。3组大鼠治疗后较治疗前LVMI、HC、CVF明显改善(P＜0.05),且比索洛尔组对于改善 LVMI、HC、CVF优于阿托伐他汀组(P＜0.05),联合用药组改善LVMI、HC、CVF优于另外两组(P＜0.05)。

表1 各组大鼠心肌LVMI、HC及CVF结果比较(±s)

表1 各组大鼠心肌LVMI、HC及CVF结果比较(±s)

组别 n SBP(mmHg) LVMI(mg/g) HC(μ g/mg) CVF比索洛尔组 治疗前 8 175.43±16.53 1.87±0.20 81.3±3.4 2.01±0.52治疗后 8 154.67±16.241)2) 1.08±0.231)2) 48.2±1.51)2) 1.29±0.321)2)阿托伐他汀组 治疗前 8 178.75±16.87 1.93±0.23 79.4±3.6 1.99±0.50治疗后 8 165.50±17.98 1.23±0.211) 50.1±1.31) 1.30±0.331)联合用药组 治疗前 8 176.31±18.23 1.97±0.22 78.7±3.8 1.98±0.49治疗后 8 142.51±17.971)3) 0.98±0.191)3) 40.6±1.11)3) 1.16±0.261)3)与同组治疗前相比,1)P＜0.05;与阿托伐他汀治疗后比较,2)P＜0.05;与比索洛尔组治疗后比较,3)P＜0.05

2.2 心肌胶原组织学测定 各组大鼠心肌VG染色,显微镜下摄图,间质胶原为紫红色,心肌细胞为黄色,治疗后较治疗前血管周围及心肌间质胶原明显减少。

2.3 各组大鼠心肌MMP-9免疫组化染色及半定量分析 3组大鼠治疗后较治疗前MMP-9表达明显降低,灰度值明显升高(P＜0.05),比索洛尔组对于降低MMP-9表达优于阿托伐他汀组(P＜0.05),联合用药组降低MMP-9表达优于另外两组(P＜0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠MM P-9免疫组化染色及半定量分析(±s)

表2 各组大鼠MM P-9免疫组化染色及半定量分析(±s)

组别 n MMP-9灰度值比索洛尔组 治疗前 8 150.874±20.176治疗后 8 161.351±16.2381)2)阿托伐他汀组 治疗前 8 149.640±19.013治疗后 8 153.844±12.8811)联合用药组 治疗前 8 151.429±20.131治疗后 8 168.657±17.3511)3)与同组治疗前相比,1)P＜0.05;与阿托伐他汀治疗后比较,2)P＜0.05;与比索洛尔组治疗后比较,3)P＜0.05

3 讨 论

高血压是最常见的心脑血管疾病,高血压的持续发展可引起心室重构、心肌纤维化。心肌纤维化是指心肌间质胶原浓度显著升高及胶原特性构型的改变,其形成机制非常复杂,涉及肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)及多种细胞因子,而各种细胞因子在影响心肌胶原合成和降解中的相互关系仍不十分清楚。在本实验中,建立了肾血管性高血压大鼠模型,通过测量大鼠LVM I,检测HC浓度,VG染色检测CVF,表明比索洛尔、阿托伐他汀、联合用药均可改善大鼠心肌纤维化,且比索洛尔组对于改善LVM I、HC、CVF优于阿托伐他汀组(P＜0.05),联合用药组改善LVM I、HC、CVF优于另外两组(P＜0.05)。β受体阻滞剂可以同时阻滞交感神经系统与肾素-血管紧张素-醛固酮系统,可以降低心室率,降低心肌耗氧量,增加冠状动脉的灌注。比索洛尔是一种高选择性β1受体阻滞剂,降低血压作用确切,且有可能降低心肌细胞促炎因子,逆转心室重构。近年来,随着几个大规模临床试验的揭晓,证实β受体阻滞剂可以减退心脏功能下降,阻止并逆转左心室肥厚,改善心脏本身的收缩功能及心力衰竭患者的预后,降低病死率[1,2]。β受体阻滞剂因其独特的药理特性已成为临床及基础研究中一个令人瞩目的热点。本研究显示,以比索洛尔为代表的高选择性β受体阻滞剂治疗肾性高血压大鼠血压疗效确切,且有效逆转大鼠心肌纤维化,其作用与抑制M MP-9的表达有关。

近年来的一系列大规模实验如4S、CARE、LIPID等均表明他汀类药物除调脂外还具有重要的非调脂作用,如稳定粥样硬化斑块、防止心室重构、抗血栓等。他汀类的这种多效性作用正日益受到人们的重视,使其成为心血管病治疗中的基础性用药之一,其作用机制可能与抑制平滑肌细胞增殖、迁移,保护血管内膜,舒张血管,抑制心肌纤维胶原合成等有关,但他汀类药物是否可以明显降低血压及其抗心肌纤维化的具体机制仍不明确。Pasquale等[3]纳入887例患者进行荟萃分析结果显示,他汀类药物组的收缩压比对照组平均低1.9 mmHg(P＜0.05)。而本实验阿托伐他汀组治疗后与治疗前相比,大鼠收缩压虽有下降趋势,却无统计学意义,可能与本实验的样本量较小、治疗持续时间短有关。

在众多的细胞因子之中,MMP-9是心肌纤维化的重要调控因素。MM P-9又称明胶酶B,是降解Ⅳ型胶原的主要成员之一,不仅在心脏基质成分的降解中起作用,而且还调节胶原蛋白的合成。Sakata等[4]高血压型 HF大鼠模型,第 23周左室无扩大,但MMP-2和MMP-9的mRNA水平与酶活性水平升高。第26周左室扩大,HF并且出现肺水肿,提示MM P-2和MM P-9升高早于左室扩大,是反映心肌纤维化的早期敏感指标。MM P-9表达的上调,参与许多心血管疾病的发生发展,而MMP-9的抑制剂则可以减弱心室重构,改善心功能。Tziakas等[5]的研究显示,阿托伐他汀治疗可降低ACS患者MMP-9水平。本研究显示,3组大鼠治疗后较治疗前M MP-9表达明显降低,灰度值明显升高(P＜0.05),比索洛尔组对于降低MM P-9表达优于阿托伐他汀组(P＜0.05),联合用药组降低MM P-9表达优于另外两组(P＜0.05)。

比索洛尔、阿托伐他汀均能有效抑制大鼠心肌纤维化的形成,其机制与降低MM P-9表达水平有关,且比索洛尔疗效优于阿托伐他汀,联合用药组疗效更加明显,二者之间存在协同作用。

[1]Simon T,Mary-Krause M,Funck-Brentano C,et al.Bisoprohol dose-response relationship in patients,with congestive heart failure,a subgroup analysis in the cardiac insufficiency bisoprolol study(CIBISIⅡ)[J].Eur Heart J,2003,24(6):552-559.

[2]Gullestad L,Manhenke C,Aarsland T,et al.Effect of metoprolol CR/XL on exercise tolerance in chronic heart failure:A substudy to the MERIT-HF trial[J].Eur J Heart fail,2001,3(4):463-468.

[3]Pasquale S,Sally MK.Do statins reduce blood pressure A meta-analysis of randomized,controlled trials[J].Hypertensions,2007,49(4):792-798.

[4]Sakata Y,Yamamoto Y,Mano T,et al.Activation of matrix metalloproteinases precedes left ventricular remodeling in hypertensive heart failure rats:Its inhibition as a primary effect of angiotensinconverting enzyme inhibitor[J].Circulation,2004,109(17):2143-2149.

[5]Tziakas DN,Chalikias GK,Parissis JT,et al.Serum profiles of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitor in patients with acute coronary sy ndromes.T he effects of short-term atorvastatin administration[J].Int J Cardiol,2004,94(2-3):269-277.