大鼠脑缺血再灌注后白细胞介素6的表达

张 金,李 阳,魏利华

目前许多研究已证实了脑缺血后损伤区有细胞因子的表达和炎性细胞的浸润,从而通过炎症反应加重组织损伤。大量证据表明,与再灌注有关的急性炎症反应促进了继发性脑损伤的发展,而缺血再灌注早期产生的炎性细胞因子构成了缺血性损伤向炎症性损伤转变的基础。而白细胞介素(IL)-6、IL-1、肿瘤坏死因子(TNF-α)等是主要的炎症因子,参与了脑缺血损伤的多个环节。其中IL-6作为一种炎症反应的前细胞因子在其中起着非常重要的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 健康成年雄性SD大鼠40只,体重为80 g～100 g,由山西医科大学实验动物中心提供。先用双肾双夹法制成高血压模型[1],再随机将高血压大鼠分为:假手术组(n=4);缺血 2 h 组再分为再灌注 3 h、12 h、24 h、3 d组(n=8)。IL-6 ELISA试剂盒购于Bender公司。

1.2 实验方法

1.2.1 肾性高血压动物模型的复制 将雄性健康的SD大鼠用双肾双夹法制成高血压模型,以普通饲料、饮水饲养,术前3 d(每日1次)连续所测血压的平均值为基础血压,术后每周测血压1次,直至血压达到180 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)以上并维持不变,饲养10周～12周。

1.2.2 局灶性脑缺血再灌注损伤动物模型的制备

1.2.2.1 尼龙线栓子的制备 参考Zea Longa方法,将一长40 mm,直径为0.205 mm的清洁鱼线一端前7 mm粘上硅橡胶成直径约0.30 mm,然后于距线球头端18.5 mm处标记。

1.2.2.2 大鼠脑缺血再灌注模型制备 取大鼠,用10%水合氯醛腹腔麻醉(35 mg/100 g)仰于手术台上,行颈正中约2 mm切口,暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)及枕动脉,用电凝器烧断ECA的分支,结扎并游离ECA主干一段,在近颅底处分离颈内动脉颅外段唯一分支-翼腭动脉,并将其起始部结扎。在ECA剪一小口,将所做成线栓子插入ECA及ICA入颅至大脑中动脉(MCA)开口处,尼龙线插入深度平均为(18.5±0.5)mm。再灌注时外拉尼龙线抽出ICA即可恢复ICA的及MCA的血液供应[2]。假手术组除不插入尼线外其余步骤同上。

1.2.2.3 大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的神经功能评分 参考Zea Longa[3]的5分制评分标准分别于大鼠术后清醒时进行评分,分为:0分,无神经损伤症状;1分,不能完全伸展对侧前肢;2分,爬行时向对侧转圈;3分,行走时身体向对侧倾倒;4分,不能自发行走,意识丧失。评分为0分和4分者均被剔除。

1.3 标本采集与保存 在规定时间断头取脑,在断头取脑前先经腹主动脉采血,室温下放置 1 h,2 000 r/min离心 30 min,分离血清于带盖聚乙烯塑料管中,放于-80℃冰箱内保存待测。脑组织自中线处分为两半,再以1 mg脑组织250 μ L双蒸水(其中加入蛋白酶抑制剂)用玻璃匀浆机制成匀浆,再用2000 r/min离心10 min,去除红细胞和碎屑,取上清液保存在-80℃冰箱内。

1.4 IL-6 ELISA检测步骤 严格按照IL-6 ELISA试剂盒的说明书进行操作,根据标准对照描绘出标准曲线,再根据所测得的OD值来计算出IL-6的浓度。

1.5 统计学处理 采用SPSS 10.0版软件进行统计学分析。数据以均数±标准差(±s)表示,血压的统计用重复测量方差分析,IL-6的浓度用双因素方差分析。组间比较进行F检验。

2 结 果

2.1 RHR血压及大鼠脑缺血再灌注模型制备 40只大鼠行肾动脉狭窄手术后1周血压即开始上升,术后第7天由平均基础血压98.3 mmHg上升到124.6 mmHg,第3周时血压达到149.6 mmHg,在第6周后血压为 188.3 mmHg,显著高出术前血压(P＜0.01),以后逐渐平稳,波动减小,此时已形成肾性高血压,再行脑缺血再灌注M ACO手术,术后出现脑缺血对侧神经功能缺损症状的为模型成功,手术意外死亡和模型不成功的有4只。

2.2 脑缺血再灌注后不同时间段IL-6在外周血及脑内的表达 大鼠局灶性脑缺血再灌注后IL-6表达在血清及脑内均有上调,在血清中IL-6的表达高峰在缺血再灌注12 h,并随时间延长其表达水平逐渐下降,在缺血再灌注24 h后降至正常水平;而在脑脊液中IL-6在缺血侧脑组织的表达在缺血2 h组再灌注3 h后就有明显升高,并且在缺血2 h后再灌注24 h后达到高峰,并且在缺血再灌注3 d后,仍维持在较高水平;在非缺血侧脑组织中IL-6的表达也明显高于外周血。详见表1。

表1 脑缺血再灌注后不同时间段IL-6在外周血及脑内的表达(±s)

表1 脑缺血再灌注后不同时间段IL-6在外周血及脑内的表达(±s)

组别 n 缺血侧(μ g/mL) 对侧脑(μ g/mL) 外周血(μ g/mL)假手术组 4 1.95±0.39 2.14±0.53 0.84±0.14缺血2 h组再灌注3 h组 8 2.77±0.41 2.24±0.40 0.55±0.37缺血2 h组再灌注12 h组 8 3.65±0.861)3) 3.01±0.801) 1.38±0.221)缺血2 h组再灌注24 h组 8 6.20±1.082)3) 4.71±0.611) 1.01±0.31缺血2 h组再灌注3 d组 8 4.40±0.931) 3.92±0.721) 0.79±0.28与假手术组比较,1)P＜0.05,2)P＜0.01;与同组外周血比较,3)P＜0.01

3 讨 论

IL-6是一种与炎症调节和免疫反应有关的多功能细胞因子,在缺血性卒中各种类型的外周血中均有IL-6的表达[4],但对于IL-6在缺血性卒中的功能不甚清楚,可能在中枢神经系统中具有致炎和抗炎的双重性。

本研究显示,大鼠局灶性脑缺血再灌注后IL-6表达在血清及脑内均有上调,尤其在脑内上调更为明显,表明脑组织中IL-6并非完全来源于外周血,脑组织自身能够产生大量的IL-6。但对于脑内IL-6的细胞来源尚不完全清楚,可能来源于神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、外周血中的单核细胞等,缺血后脑组织内有神经元及星形胶质细胞表达IL-6mRNA[5,6]。

血清中IL-6的表达高峰在缺血再灌注12 h,并随时间延长其表达水平逐渐下降,在缺血再灌注24 h后降至正常水平;而脑内缺血侧脑组织中IL-6的水平在缺血2 h组再灌注3 h后就有明显升高,并且在缺血2 h后再灌注24 h后达到高峰;在非缺血侧脑组织中也有IL-6的表达。IL-6在缺血侧高表达可能与缺血刺激诱导皮质内神经元表达有关,在非缺血侧脑组织表达可能与一侧大脑动脉缺血后引起远离缺血区的脑组织血流改变及脑组织的水肿,激活了对侧神经元所致[6]。

研究发现缺血侧脑组织中IL-6的水平明显高于对侧脑组织及外周血中的水平,并且在缺血再灌注3 d后,仍维持在较高水平,说明IL-6升高有其一定的生物学作用。许多研究发现IL-6对小鼠海马神经元免受谷氨酸诱导的细胞死亡有保护作用[7];IL-6能抑制缺血后激活胶质细胞及神经元等释放IL-1和TNF-α,并能刺激产生它们各自的循环拮抗剂,对抗IL-1和TNF-α所致的炎症损伤。但IL-6的过度表达在转基因大鼠或见血屏障的破坏和严重的神经功能障碍[8],出现震颤、共济失调和抽搐发作等。总之,脑内IL-6水平的升高并非完全来源于外周血,脑组织自身也产生IL-6,但其具体在脑内的生物学作用还有待进一步探讨。

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