葛根素后处理对大鼠心肌缺血再灌注心肌细胞的影响

颜永进,张跃明,陆 洋,王世亚

心肌缺血再灌注损伤受到临床越来越多的重视,缺血再灌注损伤成为阻碍缺血心肌从再灌注治疗中获益的主要难点,而抑制心肌细胞凋亡能有效抑制心肌再灌注损伤。葛根素(Puerarin,Pur)是中药葛根的有效成分之一,具有扩张冠状动脉、改善缺血区心肌血供、阻滞β受体、降低心肌耗氧量等多种药理作用[1,2],已被广泛用于心血管疾病的治疗。研究表明,中药Pur对再灌注损伤的心肌具有保护作用,但大多数研究都是在冠脉缺血前给予Pur预处理,而有关Pur后处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究较少[3,4]。本研究旨在利用大鼠在体心肌缺血模型,观察葛根素后处理对缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和设备 Cardiofax型心电图机(日本NIHON KOHDEN公司);小动物呼吸机(江湾Ⅰ型微型,第二军医大学医学仪器公司);Bcl-2、Bax、Tunel试剂盒购自北京中山生物工程有限公司;日本电子GEOLTEM-100S透射电镜。葛根素由南京正大天晴公司提供。

1.2 心肌缺血再灌注模型的建立[5]以3%戊巴比妥钠按50 mg/kg腹腔麻醉,气管插管,连续监测Ⅱ导联心电图。开胸暴露心脏,在冠状动脉前降支距左心耳下缘2 mm处穿过丝线,夹紧丝线阻断冠脉血流,放松丝线造成再灌注,以左室前壁发绀或呈紫色及同步心电图示ST段抬高、QRS幅度升高为结扎成功标志,复灌时左室前壁缺血区发绀消失。

1.3 实验分组 健康雄性SD大鼠24只,体重240 g～350 g(由南通医学院实验动物中心提供),随机分成3组,每组8只。假手术组(A组):将大鼠行上述处理后,只穿线,不结扎左冠状动脉。缺血再灌注组(B组):将大鼠行上述处理后,结扎左冠状动脉45 min,尔后再灌注120 min。缺血再灌注+葛根素后处理组(C组):将大鼠行上述处理后,结扎左冠状动脉 45 min,尔后再灌注120 min。再灌注前3 min和再灌注后2 min内静脉注入葛根素150 mg/kg。

1.4 心肌组织切片的制作 A组术后165 min,B组和C组在缺血45 min、再灌注120 min后为实验终点。实验结束后处死动物,立即摘取心脏,剪去心房、大血管及右室,保留左室及室间隔。用4%多聚甲醛,室温固定,石蜡包埋,连续切片,用于HE染色、T UHEL检测、免疫组化检测Bcl-2、Bax。

1.5 观测指标

1.5.1 光镜和电镜下观测心肌细胞形态学 光镜下观测各组心肌细胞的组织结构及细胞形态,电镜观测心肌细胞的超微结构。

1.5.2 原位末端标记(TUNEL)技术检测心肌细胞的凋亡 各组实验完毕后,取心肌常规脱水固定,石蜡包埋、切片,从各组取8张石蜡切片,每张切片按宝灵曼公司试剂盒(POD)提供的脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)原位检测凋亡细胞的DNA碎片。以PBS缓冲液代替管1(TdT),进行反应作阴性对照。凋亡细胞的细胞核为深浅不一的棕黄色或棕褐色,非凋亡细胞核呈蓝色。凋亡指数的计算,以单位面积内凋亡细胞数为凋亡指数(Apotosis index,AI)。每张切片随机10个视野,每个视野计数100个细胞,每个视野计数100个细胞中凋亡的阳性数,然后加在一起再除10,即可得到凋亡阳性细胞的百分率。

1.5.3 免疫组化检测Bcl-2、Bax蛋白水平 应用与 TUNEL法相同的组织石蜡切片行Bax、bcl-2蛋白免疫组织化学检测。一抗1:50PBS稀释的 Bax、bcl-2抗体。具体步骤严格按SP试剂盒说明操作,DAB显色,中性树脂封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。蛋白阳性表达细胞的细胞质呈棕黄色或棕褐色,细胞核呈蓝色为不表达。每张切片随机10个视野,每个视野计数100个细胞中Bax、bcl-2蛋白表达阳性的细胞数,然后加在一起再除10,即可得到蛋白阳性表达的百分率。

1.6 统计学处理 采用STATA8.0软件进行处理,所有数据采用均数±标准差(±s)表示,对均数进行方差分析(F检验),两组间比较用t检验。

2 结 果

2.1 心肌组织形态学分析 光镜下:A组心肌纤维形态正常,未见明显的坏死表现,细胞核完整,无炎性细胞浸润;B组心肌纤维形态结构紊乱,无炎性细胞浸润,可见凋亡细胞,呈细胞体积缩小,密度增加,但细胞器保持完整;C组心肌纤维形态趋于正常,无炎性细胞浸润。

电镜下:A组细胞形态正常;B组可见细胞体积缩小,核浓缩,胞质内细胞器完整,并形成凋亡小体,无炎性细胞浸润等凋亡改变;C组细胞形态趋于正常,与B组相比,细胞损伤有明显减轻,大部分核染色质分布均匀,超微结构趋于与A组细胞相似。

2.2 心肌细胞凋亡的检测 A组偶见凋亡的心肌细胞,B组凋亡细胞明显增加,呈弥漫分布,C组凋亡细胞较少。B组有较高的心肌细胞凋亡率,较A组明显增高(P＜0.05);与B组比较,C组心肌细胞凋亡率明显降低(P＜0.05)。详见表1。

2.3 Bcl-2及 Bax蛋白表达水平 Bcl-2及Bax蛋白阳性定位于细胞质中,呈棕黄色。B组Bcl-2阳性细胞表达率明显低于A组(P＜0.05),而Bax阳性细胞表达率明显高于 A组(P＜0.05);与B组比较,C组Bax阳性细胞表达率明显下降(P＜0.05),而Bcl-2阳性细胞表达率明显上升(P＜0.05)。详见表 1。

表1 不同处理组凋亡细胞及Bcl-2、Bax蛋白(±s)

表1 不同处理组凋亡细胞及Bcl-2、Bax蛋白(±s)

组别 凋亡指数(%) Bcl-2(%) Bax(%)A 组 0.509±0.126 5.618±0.685 0.651±0.083 B组 3.518±0.8641) 0.592±0.4131) 4.982±0.2361)C组 2.075±0.9832) 3.948±0.4132) 1.985±0.5162)与A组比较,1)P＜0.05;与B组比较,2)P＜0.05

3 讨 论

葛根素是从野生葛根中提取得到的类异黄酮类化合物,能改善微循环,扩张冠状动脉,增加脑和冠状动脉血流量等作用,临床用于冠心病、高血压等。目前已知的保护心脏,减少心肌缺血再灌注损伤最有力的方法是缺血预适应或缺血后适应[6,7]。近年来实验及临床研究均证实葛根素预处理对心肌I/R损伤具有良好的保护作用[8],但对于葛根素后处理以及它对细胞凋亡和凋亡相关基因 Bcl-2、Bax作用,对心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究较少。

细胞凋亡是有许多基因参与的细胞结束其生命的过程,有着非常复杂的调控机制,其中Bcl-2基因家族是目前较为公认与凋亡密切相关的基因。Bcl-2家族正是一组通过影响线粒体外膜上通透性转换(permeability transition,PT)通道的稳定性来调控细胞凋亡的蛋白质。Bcl家族大致可以分为两类:Bcl-2,Bcl-xL等可以抑制凋亡;而Bax,Bad等则可以通过增加PT通道的开放来促进细胞凋亡。Bcl-2抗凋亡的作用可能与抗氧自由基,钙超载及细胞内蛋白酶变化有关,也可能与Bcl-2能保持线粒体膜的稳定性,抑制细胞色素C和凋亡诱导因子释放有关。Bcl-2家族中Bax功能与Bcl-2相反,具有促进细胞凋亡的作用,Bax通过与线粒体上Bcl-2蛋白形成二聚体发挥作用,当Bax高表达时,形成同源二聚体Bax/Bax促进凋亡,Bcl-2高表达时,形成异源二聚体Bcl-2/Bax以抑制凋亡的发生[9-11]。

本研究发现,正常心肌细胞有一定量的Bcl-2、Bax表达;当心肌遭遇缺血再灌注时,Bcl-2的表达下调,而Bax表达上调同时伴有心肌凋亡细胞的增多;葛根素后处理可以提高Bcl-2表达,降低Bax表达,而且显著减少心肌细胞的凋亡。

本研究观察葛根素后处理对缺血再灌注心肌的保护作用,对缺血再灌注心肌组织结构、细胞凋亡及相关基因Bcl-2、Bax蛋白的表达进行了观察。葛根素后处理能明显减少心肌细胞的凋亡,其机制可能通过上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达来实现的。葛根素后处理是在心肌缺血发生之后进行的,弥补了葛根素预处理临床应用的缺陷,因此更具临床前景。

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