反相高效液相色谱法检测食品添加剂乳铁蛋白

张林田，陈小雪，魏建华，张冬辉，陈建伟

（汕头出入境检验检疫局，广东汕头515041）

反相高效液相色谱法检测食品添加剂乳铁蛋白

张林田，陈小雪，魏建华，张冬辉，陈建伟

（汕头出入境检验检疫局，广东汕头515041）

建立反相高效液相色谱法检测食品添加剂乳铁蛋白的方法。样品采用氯化钠溶液（0.5 mol/L）溶解，过滤后供液相色谱仪测定。采用CAPCELL SG300 C18色谱柱分离，氯化钠溶液（0.5 mol/L）、乙腈及三氟乙酸为流动相，梯度洗脱，二极管阵列检测器280nm检测，保留时间及特征光谱图定性，外标法峰面积定量测定。标准曲线线性范围10.0mg/L～100 mg/L，相关系数均在0.999以上，定量检测低限5 mg/kg。

高效液相色谱；添加剂；乳铁蛋白

Abstract：A determination of food additive lactoferrin by reverse phase high-performance liquid chromatography is described.The lactoferrin is extracted from the samples with the sodium chloride solution of 0.5 mol/L,filtered,and analyzed at 280 nm by high-performance liquid chromatography with DAD.The chromatographic separation is carried out on CAPCELL SG300 C18column with ramp mobile phase using the sodium chloride solution of 0.5 mol/L,acetonitrile and trifluoroacetic acid.The qualitation of lactoferrin depends on the RT and characteristic UV spectra;quantified by external standard calibration curves.The calibration curve is linear in the 10.0 mg/L-100 mg/L range with correlation coefficients≥0.999.The limit of detection and quantification is 5 mg/kg.The analytical method is simple,fast and precise with a good sensitivity,an excellent reproducibility.

Key words:HPLC;additive;lactoferrin

乳铁蛋白是浅红色，干燥、均匀的粉末，无味，是一种铁结合性糖蛋白，属于转铁蛋白家族。分子的主体由氨基酸残基构成的、相对分子质量80 ku，它被认为是安全的食品添加剂，日本、美国等许多国家批准其应用于食品行业已有几十年[1]，我国GB 2760-2007《食品添加剂使用卫生标准》中允许乳铁蛋白添加于婴幼儿配方食品、较大婴儿和幼儿配方食品中，最大允许使用量为1.0 g/kg。

商业所用乳铁蛋白主要来源于牛乳，目前国外主要采用离子交换色谱和超滤等方法从废弃乳清或脱脂奶粉中提取，生产成本较高[1]，每公斤乳铁蛋白售价约1800元，是普通蛋白粉的6倍。而国内乳铁蛋白由于生产工艺技术尚未成熟，纯度低、价格高，还未能工业化生产。市场上常见的乳铁蛋白添加剂大体都是采用纯度大于90%的进口产品。由于乳铁蛋白（LF）价格昂贵，许多不法分子以次充好，以低纯度LF冒充优质乳铁蛋白添加剂以获取暴利，坑害消费者的权益。我国对食品添加剂乳铁蛋白的需求越来越多，但目前尚无国家标准。为了规范市场，保障人民身体健康，建立乳铁蛋白的检测方法是迫在眉捷。参考国内外文献，经试验验证，建立了高效液相色谱法检测乳铁蛋白含量，该方法采用氯化钠溶液溶解样品，过滤后供液相色谱仪测定，采用CAPCELL SG300 C18色谱柱分离，氯化钠溶液、乙腈及三氟乙酸为流动相，梯度洗脱，二极管阵列检测器280 nm检测，保留时间及特征光谱图定性，外标法峰面积定量测定。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

HP1100高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器，美国惠普公司生产。

乙腈、三氟乙酸、0.5 mol/L氯化钠溶液。

标准溶液：准确称取50.0 mg乳铁蛋白标准品于烧杯中，用少量氯化钠溶液溶解后转移到50 mL容量瓶中并定容，配制成浓度为1000 mg/L标准储备液。

1.2 液相色谱分离条件

色谱柱：CAPCELL SG300 C18柱，4.6 mm×150 mm，粒度5μm（或相当色谱柱）。流速：1mL/min。柱温：30℃。检测波长：280 nm。进样量：25 μL。流动相 A：乙腈-氯化钠溶液-三氟乙酸=45＋450＋0.15，B:乙腈-氯化钠溶液-三氟乙酸=500＋500＋0.30。梯度洗脱见表1。

表1 梯度洗脱Table 1 The composition and ramp mobile phase

1.3 样品前处理

称取100 mg试样（精确至0.1 mg）用氯化钠溶液溶解，转移至100 mL容量瓶中并定容。再依据实际需要稀释适当倍数。

2 结果和讨论

2.1 液相色谱柱的选择

在本试验中，比较了 Vydac C18、MERCK C18、Agilent C18、CAPCELL SG300 C18等各种类型的色谱柱，只有CAPCELL SG300 C18柱能使乳铁蛋白得到良好分离，同时保留时间也合适。这可能是由于蛋白体积大，易与硅胶金属发生亲合作用形成盐，产生了较多的死吸附，峰形变得较差，峰拖尾、分配性差。CAPCELL SG300色谱柱采用包膜之后硅羟基的残留量接近0，使得蛋白里的氨基酸尾部没有机会与硅羟基咬合，因此不会在分离过程中产生死吸附。

2.2 流动相的选择

本试验在进行流动相的选择时，比较了0.1%TFA水溶液与甲醇-水-0.1%TFA（95∶5∶0.1）、异丙醇-水-0.1%TFA（95∶5∶0.1）、10 mmol/L 磷酸、乙腈-氯化钠溶液-三氟乙酸（45＋450＋0.15）[2]作为流动相对乳铁蛋白的分离效果，结果表明，选用乙腈-氯化钠溶液-三氟乙酸（45＋450＋0.15）及乙腈-氯化钠溶液-三氟乙酸（500＋500＋0.30）作为流动相并梯度洗脱，能使主成分与相邻杂蛋白峰基线分离，同时保留时间也较为合适。

2.3 标准色谱图、标准曲线、相关系数及检测低限

将乳铁蛋白标准储备液用氯化钠溶液配成10、20、40、60、80、100 mg/L 的标准系列，进高效液相色谱仪测定，以浓度对应峰面积建立校准曲线，校准方程为Y=1.36503X-4.50996，相关系数为0.9987。根据6×SD/b（SD为6次空白的标准偏差；b为标准曲线斜率）结合具体情况，确定最低出限为5 mg/L。图1为50 mg/L乳铁蛋白标准溶液液相色谱图，乳铁蛋白保留时间为9.6 min。图2为对应的二极管阵列光谱图。样品以保留时间结合光谱图辅助定性。

2.4 特异性试验

乳铁蛋白通常采用pH调节、盐析、酸沉降、阳离子交换层析分离纯化技术，但残存的杂蛋白，如血清白蛋白（牛）、β-乳球蛋白等有可能对测定存干扰。验证血清白蛋白（牛）、β-乳球蛋白与乳铁蛋白在同样液相条件下的分离效果，试验结果表明，血清白蛋白（牛）、β-乳球蛋白保留时间分别为8.36min和8.25min，而乳铁蛋白的保留时间则为9.64 min。图3为3种蛋白等浓度混合溶液的液相色谱图。

2.5 精密度试验验证

按上述10份乳铁蛋白样品，按本检测方法取进行测定，结果如表2。

从试验结果可知，10次测定结果的相对标准偏差为3.7%。另请5家单位对我们所提供的3份样品按本法进行乳铁蛋白含量测定。试验数据见表3，由试验数据可知，相对标准偏差均小于2%。说明该方法室间定内的重现性均能满足要求。

表2 乳铁蛋白精密度试验验证结果Table 2 Results of inner-lab reproducibility（n=10）

表3 乳铁蛋白室间验证数据Table 3 Results of inter-lab reproducibility（n=12）

3 结论

本研究用氯化钠溶液溶解样品后直接采用高效液相色谱测定，以保留时间及特征光谱图定性，外标法峰面积定量测定添加剂中乳铁蛋白含量，具有简便、快速、准确、高效的优点。

[1]龚广予,巫庆华,吴正钧.乳铁蛋白的生理功能[J].中国乳品工业,2001,29(1):21

[2]许宁,李士敏.牛乳铁蛋白的反相高效液相色谱法含量测定[J].药物分析杂志 ，2004，24(1)：49-51

Study of Determination of Food Additive Lactoferrin by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Lin-tian，CHEN Xiao-xue，WEI Jian-hua，ZHANG Dong-hui，CHEN Jian-wei
（Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shantou 515041,Guangdong,China）

2010-04-13

国家质检总局项目（20071903-T-424）

张林田（1971—），男（汉），高级工程师，大学，从事食品卫生检测。