泥鳅鱼黑色素抗氧化作用

2010-09-12张莲姬

食品研究与开发 2010年8期

关键词：黑色素泥鳅过氧化

张莲姬

（延边大学农学院，吉林龙井133400）

泥鳅鱼黑色素抗氧化作用

张莲姬

（延边大学农学院，吉林龙井133400）

采用荧光光度法和分光光度法研究泥鳅鱼黑色素清除羟基自由基、有机自由基DPPH以及抑制蛋黄的脂质过氧化作用。试验结果表明：在一定浓度范围内随着泥鳅鱼黑色素浓度的增加，黑色素的抗氧化作用逐渐增强，但浓度增加到一定程度其抗氧化作用的增强不再明显。清除50%的羟基自由基和有机自由基DPPH所需要的泥鳅鱼皮黑色素的浓度分别为0.38 mg/mL和0.1 mg/mL，抑制蛋黄的脂质过氧化试验中抑制率达到50%时泥鳅鱼皮黑色素浓度为0.22 mg/mL。

泥鳅鱼；黑色素；清除；抗氧化性

Abstract:Based on the fluorophotometry and spectrophotoemtry,this paper mainly studies that the loach melanin eliminates the hydroxyl radical,organic radical DPPH and inhibits the lipid peroxidation of the yolk.Experimental results show that with the loach melanin concentration's increase in a certain range,the antioxidant of the melanin is getting bigger and bigger.However,when the concentration increases to a certain level,the strength of the antioxidant is not so obvious any more.The concentration that needs to eliminate 50%of the hydroxyl radical and organic radical DPPH are 0.38 mg/mL and 0.1 mg/mL respectively.The concentration of the loach melanin is 0.22 mg/mL,when the rate of inhibition achieves 50%in the experiment of lipid peroxidation of the yolk.

Key words:loach;melanin;eliminating;antioxidant

黑色素（Melanin）是一类复杂的含氮高聚物，它是广泛存在于植物、动物和微生物中的重要色素，是酪氨酸及其相关化合物代谢的最终产物[1]，具有与众不同的物理化学特性和重要的生理特征。动物源黑色素大致可分为两大类[2]：真黑色素（EumcLanin），它是黑色或棕色的含氮大分子；浅黑色素（Pheomclanin），它是红色、黄色或棕色的色素。

天然黑色素虽然对于生物的生长、发育不是必不可少的，但却能提高生物生存、竞争的能力[3]。不同来源的黑色素都有一定的特异性，具有很大应用潜力，所以天然黑色素资源开发是当前研究的一大热点。

进入21世纪一些天然黑色素逐渐应用在各个领域中。如在食品工业中黑芝麻、黑米、黑豆中的黑色素应用在饮料、糖果、糕点、巧克力、果酱等[4]。研究还表明，黑色素具有抗氧化和防止衰老等功能[5]，这将大大促进天然黑色素在保健食品中的应用。天然黑色素在化学工业上也日益受到欢迎，可在黑发剂、防晒霜等产品中应用。黑色素除具有上述作用外，还具有以下几个方面药理作用[6]：具有延长肾上腺素活性作用，从而维持血管产生渗透压，降低血管脆性，缩短流血时间；抗菌作用，其作用受其浓度影响，低浓度能抑制细菌，高浓度能杀菌；抑制癌细胞生长或抗癌作用；解痉挛作用；用以治疗某些与黑色素缺乏有关神经系统疾病，如着色性干皮病、帕金森氏症、老年性痴呆症、亨廷氏舞蹈病等[7-8]。

近年来发现一些可溶性黑色素在体外对艾滋病病毒有显著的抑制作用，使天然黑色素将来有可能成为一种新的艾滋病药物[9]。所以天然黑色素替代合成黑色素，有着十分广阔的应用前景，越来越受到人们的青睐，许多科研工作者已经对其进行研究开发[10-16]。

泥鳅生活于湖塘、沟渠、水田等地方，除西部高原外，全国南北各地均有分布，是常见的淡水小型食用鱼类，其肉质细嫩，是一种营养价值较高的黑色食品。而且泥鳅鱼原料易得，从其中提取黑色素的工艺很简单，这些特点都证明泥鳅鱼具有较高的研究价值和开发潜力，但目前为止鲜见有关泥鳅鱼皮黑色素抗氧化作用报道。为了有效地开发、研究和利用这一天然资源，本文研究了泥鳅鱼皮黑色素清除羟基自由基、有机自由基DPPH以及抑制蛋黄的脂质过氧化作用，提出了有意义的参考数据。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料

泥鳅鱼购买于吉林省龙井市市场。

1.2 试剂

试剂：NaOH溶液、CuSO4溶液、苯甲酸溶液、抗坏血酸溶液、pH=7.4磷酸缓冲溶液、DPPH溶液、95%乙醇、硫代巴比妥酸、蛋黄悬液、正丁醇、醋酸。

1.3 仪器

HH-S恒温水浴锅：金坛市恒丰仪器厂；TDL-5000B型低速冷冻多管离心机：上海安亭科学仪器厂；FA/JA型电子天平、PHS-3C型精密pH计、756MC紫外可见分光光度计、960MC荧光分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；振荡器；电热鼓风干燥箱：天津实验仪器厂。

2 方法

2.1 泥鳅鱼皮黑色素提取分离工艺流程

干泥鳅→粉碎→酸水解→离心→过滤→碱溶→静置12 h→离心→过滤→酸沉→静置12 h→离心→乙醇洗涤→干燥→粗黑色素

2.2 泥鳅鱼皮黑色素的提取及纯化

黑色素在体内与蛋白质、多糖结合紧密，不易分离。本试验首先采用盐酸来水解去除与黑色素结合的蛋白质、碳水化合物和脂类物质，然后利用黑色素易溶于碱的性质提取黑色素，最后加酸使黑色素重新沉淀出来。

2.2.1 泥鳅鱼黑色素的酸水解

将粉碎的干燥泥鳅20.00 g，放入500 mL锥形瓶中，加入 200 mL、5 mol/L HCl，在 60℃条件下水解 3 h，时而搅拌，适当盖上盖子。离心去除滤液后得到含黑色素的沉淀物。

2.2.2 泥鳅鱼黑色素的碱溶

离心所得到的沉淀物用蒸馏水洗至中性后加入200 mL、5 mol/L NaOH，室温静置 12 h，离心即得到含有黑色素的滤液。

2.2.3 泥鳅鱼黑色素的酸沉

将离心所得到的含有黑色素的滤液用5 mol/L HCl调节pH值至1，使黑色素沉出，室温静置12 h，离心分离，其沉淀即为泥鳅黑色素粗提取物。

2.2.4 泥鳅鱼黑色素的纯化

将泥鳅黑色素粗提取物，用盐酸和氢氧化钠进行重结晶后，用蒸馏水反复洗涤（至少5次）至滤液不含氯离子为止（用0.1 mol/L的硝酸银溶液检查），最后用乙醇洗涤，60℃烘干干燥得成品。

2.3 泥鳅鱼黑色素清除羟自由基的测定

用荧光分光光度法测定[17]，其原理为通过硫酸铜和抗坏血酸反应体系产生羟自由基，羟自由基可氧化苯甲酸且其产物在一定的激发波长下具有较强的荧光，黑色素能有效地清除活性氧自由基，导致反应体系荧光强度减弱。

在10 mL具塞比色管中加入5.0 mLpH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液、0.3 mL 1.14 mmol/L的硫酸铜溶液、1.2 mL0.925mmol/L的苯甲酸溶液和1.0mL0.97mmol/L的抗坏血酸溶液，之后定容至10 mL摇匀，在室温下放置30 min，在激发波长为294 nm条件下测定411 nm处的荧光强度（I）。同时作空白试验在相同条件下不加硫酸铜溶液和抗坏血酸溶液，测其荧光强度为I0（空白值），则实际由羟自由基与苯甲酸反应产生的体系的荧光强度为（I-I0）（羟基自由基的产生阶段）。在若干个上述反应体系中分别加入不同浓度的黑色素溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/L），在相同的激发波长下测得其荧光强度Im，羟自由基清除率与黑色素加入量正相关[17]，羟自由基清除率的计算公式如式（1）：

2.4 泥鳅黑色素清除有机自由基DPPH的测定

测定原理：DPPH（1,1-二苯基苦基苯肼）在517 nm处有一较强吸收峰，其乙醇溶液呈深紫色。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数成定量关系，因而可用分光广度法进行定量分析。

向2 mL DPPH溶液中加入2 mL不同浓度的黑色素溶液，总体积为4 mL，摇匀，于25℃水浴中放置30 min后倒入光径为1 cm的比色皿中，用紫外可见分光光度计在517 nm波长处测定上清液的吸光度A样品（用2 mL 95%乙醇和其对应浓度的黑色素溶液来调零点，以扣除试剂本身的颜色影响），向2 mL DPPH溶液中加入2 mL相应黑色素溶液的溶剂（0.1 mol/L NaOH溶液，用2 mL 95%乙醇和其黑色素溶液的溶剂来调零点），记录吸光度值为A空白，即空白对照,DPPH的清除率的计算公式如式（2）[18]：

2.5 泥鳅鱼黑色素抑制蛋黄的脂质过氧化作用

参考硫代巴比妥酸反应物质法（TBARS法），TBARS方法是通过硫代巴比妥酸与丙二酚及其他脂质过氧化产物的显色（淡红色）反应来进行检测的一种方法。反应产物在532 nm波长处的吸光度值可以表征脂质过氧化的程度。取3支10 mL试管，分别在其中加入2 mL 10%的蛋黄悬液，1 mL不同浓度的黑色素水溶液，然后加入10%的三氯乙酸2 mL，0.8%的硫代巴比妥酸（含1.1%SDS十二烷基硫酸钠）2 mL。将几支试管涡流振荡混合均匀，在95℃下加热60 min。冷却至室温后，振荡均匀，以3000 r/min离心10 min。然后用紫外可见分光光度计在532 nm波长处测定上清液的吸光度，同时按上述方法测不加黑色素的吸光度。黑色素的最终浓度为 0.05、0.10、0.20、0.25、0.30 mg/mL。按式（3）计算黑色素的抗氧化指数AI%[19]：

式中：AC为不含黑色素体系的吸光度；AT为含黑色素体系的吸光度。

3 结果与分析

3.1 荧光光度法测定泥鳅鱼黑色素

图1为荧光分光光度法测定的不同浓度的泥鳅鱼黑色素对羟自由基的清除率的影响。

图1表明随着泥鳅鱼黑色素加入量的增加，羟自由基的清除率也逐渐增加。但是当其浓度增加到一定程度（0.6 mg/L）以后，清除率的增加已不明显。当泥鳅鱼黑色素浓度达到1.2 mg/mL时，其抑制率达到70%，对清除羟自由基的效果最好。IC50（抑制率达到50%时黑色素浓度）为0.38 mg/L。

3.2 黑色素清除有机自由基DPPH的能力分析

图2为分光光度法测定的不同浓度的泥鳅鱼黑色素对DPPH自由基清除率的影响。

图2表明泥鳅鱼黑色素浓度在0.025 mg/mL~0.2 mg/mL范围内抑制率逐渐上升，但当黑色素浓度高于0.2 mg/mL以后其抑制率增加基本趋于平稳。当泥鳅鱼黑色素浓度达到0.2 mg/mL时，其抑制率达到59%，对清除DPPH自由基的效果最好。IC50（抑制率达到50%时黑色素浓度）为0.1 mg/mL。

3.3 黑色素抑制蛋黄的脂质过氧化作用分析

图3为按照TBARS方法测定的不同浓度的泥鳅鱼黑色素对蛋黄脂质过氧化抑制率的影响。

图3结果表明泥鳅鱼黑色素在0.05 mg/mL~0.25 mg/mL浓度范围内抑制率为逐渐上升的趋势，但当黑色素浓度继续增大0.25 mg/mL时，清除率趋于平缓。黑色素浓度在0.25 mg/mL时其对蛋黄脂质过氧化的抑制率效果最好，抑制率为52%。IC50（抑制率达到50%时黑色素浓度）为0.22 mg/mL。

3.4 泥鳅鱼黑色素与其他抗氧化剂的比较

为了进一步证明，泥鳅鱼黑色素较强的抗氧化作用，与另外两种典型抗氧化剂硫脲和尿素比较了清除羟自由基的能力，结果如表1。

表1 泥鳅鱼黑色素与其他抗氧化剂清除50%羟自由基能力的比较Table 1 Comparison of loach melanin and other antioxidants on the ability of eliminating 50%hydroxyl radicals

从表1中可以看出，泥鳅鱼黑色素对羟自由基的清除率高于硫脲和尿酸，特别是在一定浓度范围内这种优势更明显。

4 结论

本试验首先利用天然黑色素溶于碱，酸沉的性质，从干泥鳅鱼中提取黑色素，并且对它进行提纯。所得到的干燥的泥鳅鱼黑色素配成不同的浓度，然后采用荧光光度法和分光光度法研究泥鳅鱼皮黑色素的抗氧化作用。得到的结果为：清除50%的羟自由基、有机自由基DPPH，抑制50%的蛋黄脂质过氧化所需泥鳅鱼黑色素浓度分别为0.38、0.1、0.22 mg/mL，清除有机自由基DPPH的效果优于其余两者。泥鳅鱼黑色素跟其他典型抗氧化剂硫脲和尿素相比也表现出更好的清除羟基自由基的能力。以上结果说明泥鳅鱼黑色素具有明显的抗氧化活性，可以有效的防止羟自由基、有机自由基DPPH等对人体造成伤害，从而提高免疫力，也提示泥鳅鱼黑色素潜在的应用价值，或许将来能成为抗衰老保健食品辅料或功能因子。但本研究所得到的泥鳅鱼黑色素进一步的分离纯化和构效关系尚待深入研究。

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