液体乳中抗生素残留量快速检测方法探究

俞漪，胡雪莲，巢强国，熊薇

（上海质量监督检验技术研究院，上海200233）

液体乳中抗生素残留量快速检测方法探究

俞漪，胡雪莲，巢强国，熊薇

（上海质量监督检验技术研究院，上海200233）

抗生素在畜牧业中广泛应用，不可避免地造成牛奶中残留抗生素。抗生素残留不仅危害人类健康，同时也影响牛奶的品质，造成经济损失。现检测生鲜乳中抗生素残留量方法众多。对3种快速检测方法（SNAP双流向酶联免疫法、嗜热链球菌抑制法（TTC）和ECLIPSE50试剂盒微生物抑制法）进行了比较，以寻求简便、快速、准确、敏感性高的方法，以满足日趋严格的残留限量要求，保障人们饮用牛奶的卫生和安全。

抗生素残留量；SNAP双流向酶联免疫法；嗜热链球菌抑制法（TTC）；ECLIPSE50试剂盒微生物抑制法

Abstract:Extensive use of antibiotics in animal husbandry,will inevitably result in antibiotic residues in milk.Antibiotic residues are not only harmful to human health,but also affect the quality of milk,resulting in economic losses.Health is now testing antibiotic residues in milk many methods.In this paper,three kinds of rapid detection methods(SNAP pairs of the flow of enzyme-linked immunosorbent assay,inhibition of Streptococcus thermophilus(TTC)and ECLIPSE50 Kit microbial inhibition method)were compared in order to seek simple,rapid,accurate and sensitive method of high in order to meet the increasingly stringent requirements residue limits to protect people's health and safety of drinking milk.

Key words:antibiotic residues;SNAP double-flow enzyme-linked immunosorbent assay;inhibition of Streptococcus thermophilus(TTC);ECLIPSE50 microbial inhibition assay kit

抗生素主要指由微生物产生的、能抑制或杀死其他微生物的一类化学物质。在乳品业中常用β-内酰胺类、四环素类、磺胺类等抗生素用作畜类乳房炎、子宫内膜炎等疾病的治疗；也有一些生产者在饲料中添加抗生素，以改善畜禽的新陈代谢，促进畜禽生长，提高畜禽成活率和饲料转化率[1]。食品和药品管理局（FDA）的调查表明：不注意休药期、用药不合理或是使用违禁药物，是导致乳品中抗生素残留的主要原因。长期摄入含抗生素的乳品，可造成药物积累，当其达到一定浓度后，就会对人体的健康带来一系列的负面影响[2]。近年来，随着食品安全问题的日益受到人们的关注，乳品中的抗生素残留监控也越来越受到各生产企业以及行业监管部门的重视。

目前，我国液体乳中抗生素残留多采用国标GB/T 4789.27-2008《食品微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验》的方法，近年来随着检验技术的不断发展，许多新的检验手段被用于生鲜乳中抗生素残留量的检测。然而，就我国乳品业的产业链以及原料乳收购模式而言，一些对实验室和检测人员要求较高的检测方法，如光谱法、色谱法及色谱-质谱联用技术其灵敏度高于微生物法[3]，在基层难以推广。乳品企业与各级监督部门需要简便、快速、敏感性高且相对准确的检测方法用于对原料乳、生鲜乳抗生素残留的快速筛查以满足日趋严格的残留限量要求。

本文将用两种方法检测乳品业中常用的β-内酰胺类、四环素类、磺胺类抗生素残留量研究，并与国标TTC法进行了比较和分析。

1 仪器、试剂和菌种

SNAP双流向酶联免疫法抗生素检测仪及试剂盒（北京安普生物技术有公司；型号：SNAPshotTM）；尖盖恒温水浴摇床（北京五洲东方科技有限公司；型号：WB22）、培养箱(上海科端生物科技有限公司；型号：SHELLAB)、10 mL（1 mL）灭菌吸管、1000 μL（200 μL）加样枪及配套枪头；15 mm×150 mm试管等。

选取市售无抗巴氏杀菌奶作为阴性对照（液相色谱-质谱联用法，确认其中不含β-内酰胺类、四环素类、磺胺类抗生素[4-6]）以及抗生素标样（均为Sigma品牌）；脱脂奶粉：按国际法还原成复原乳，经115℃15 min灭菌，4℃保存；4%TTC指示剂：121℃15 min灭菌，避光4℃保存；磷酸盐缓冲溶液（pH6.0）：121℃20 min灭菌，4℃保存；0.1 mol/L盐酸溶液；SNAP双流向酶联免疫法抗生素检测仪试剂盒（β-内酰胺类、四环素类、磺胺类抗生素）；ECLIPSE 50试剂盒。

嗜链球菌菌种（ATCC19258）培养、保存、传代[7]。

抗生素稀释：将各类抗生素用0.1 mol/L盐酸溶液溶解并稀释定容至浓度为1000 μg/mL储备液，配置后置于4℃中保存一周。用上述的储备液用市售的无抗奶稀释配制成 100、50、20、10、6、4 、2 μg/mL 作为模拟样品。需使用当天配制。

2 方法和讨论

2.1 TTC法

国标嗜热链球菌抑制法（TTC法）按国家标准方法GB/T4789.27-2008《食品微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验》[7]。

TTC 法其原理是：2，3，5-氯化三苯四氮唑（TTC）会与活菌体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的代谢产物。将液体乳高温杀菌后添加嗜热链球菌菌液，37℃培养一段时间后加入TTC进行显色。若该液体乳样品中不含抗生素或含量低于检测限，嗜热链球菌会继续增殖将TTC还原并产生红色物质（阴性结果）；相反，若样品中含有高于检测限的抗生素，则菌体生长受到抑制，指示剂TTC不能被还原，检测试管将保持其液体乳原有的白色（阳性结果）。TTC法是较早用于液体乳中抗生素残留定性检测的方法。也是我国实验室里普遍使用的方法。其成本低廉、操作简单，但由于需要增菌步骤，需要近3 h才能完成检测。此外，该方法会受到接种量、菌株的活性、灭菌脱脂乳的营养情况、TTC溶液的保存情况等多种因素的干扰，致使其检测结果有时不太稳定[8]。当液体乳中抗生素含量在检出限附近时，如阳性为乳白色，阴性由于TTC的作用为粉红色，但有时候会出现这两者之间的颜色，人为难以判读的现象，造成了试验结果误差。

在液体乳中加标后的抗生素残留结果，见表1。

由表1可见：TTC法对于以青霉素、阿莫西林为代表的β-内酰胺类抗生素较为灵敏，检出限为10 μg/mL~20 μg/mL；对于四环素族的抗生素，该方法的检出限为100 μg/mL；而磺胺类抗生素在高浓度下不能抑制嗜热链球菌生长，嗜热链球菌都被TTC还原成红色物质，TTC法不能用于精确检验牛乳中磺胺类药物残留是否超过最高限量(100 μg/mL)[9]。

表1 嗜热链球菌抑制法检测结果Table 1 Streptococcus thermophilus cultured suppression method test results

2.2 SNAP双流向酶联免疫法

按操作手册规定的方法进行。

加样于具有酶标记物的配套试管中，摇匀，与试剂盒置于加热器上加热5 min。加样于样品孔中，当激活圆环开始退却时，按SNAP键。反应4 min；SNAP读数仪读取。检测读数≤1.05时判为阴性，＞1.05时判为阳性。

SNAP双流向酶联免疫法的检测原理基于竞争性酶联免疫技术。样品内的抗生素与试管内的酶标记抗体在（45±5）℃共同保温下充分结合，剩余的酶标记抗体与试剂盒上内置的抗生素结合，然后进行洗涤，通过酶的作用分解可形成有色物质测定色度并与参照物对照，就可以确定结果是否阴阳性。

以SNAP双流向酶联免疫法检测液体乳中抗生素残留结果，见表2。

表2 SNAP双流向酶联免疫法检测结果Table 2 SNAP double flow enzyme-linked immunosorbent method test results

由表2可见：SNAP双流向酶联免疫法对于β-内酰胺类抗生素检出限可达3 μg/mL~4 μg/mL；对于四环素族的抗生素，检出限为 50 μg/mL（四环素为20 μg/mL）；对于磺胺类抗生素该方法的检出限为10 μg/mL。样品中的抗生素含量在试剂盒标准值附近时，在反复检测中可能会出现几次检测结果标准值上下浮动的现象。经美国官方分析化学师协会（AOAC）规定同一样品在三次检测中有两次在标准值上线，就判为阳性。

SNAP双流向酶联免疫法最大的优势是检出限低，检测便捷迅速。可见，在抗生素低浓度的一定范围内，SNAP检测法的灵敏度高于TTC法。SNAP检测试剂盒体型轻巧、便于携带、使用简单，10 min左右便可作出定性检测的结果。其作为一种现场快速检验方法，能快速筛查出阳性和国标法难以判断的样品，非常适合野外加工厂环境及有关部门现场执法时的使用。在TTC法易出现假阳、阴性现象，特别是嗜热链球菌量添加对结果影响很大，添加数量过多会产生假阴性结果，加入的量过少，则出现假阳性的结果。而SNAP双流向酶联免疫法所受的实验外界影响很少，无假阳、阴性现象。SNAP双流向酶联免疫法对常用抗生素类都有其相应的耗材，能对样品中的抗生素进行分类，这是TTC法和ECLIPSE50微生物抑制法所不能做到的。但SNAP法的基本原理决定了其针对不同种类的抗生素检测需要在试剂盒中包被相应的抗生素。对于一个待测样品，一次检验仅能判定其是否含有某一类特定的抗生素，而无法检测其抗生素残留总量，所使用的耗材是较昂贵的进口产品，相应的检测成本就会大大的提高，也成为SNAP法在基层推广的弊端之一。SNAP双流向酶联免疫法的另一缺点是，该试剂盒中的膜的孔径非常细小，无法用于检查流动性不佳的样品。因此，该方法仅适用于新鲜的液体乳样品。

2.3 ECLIPSE50微生物抑制法

按操作手册规定的方法进行。

96孔板的各个微孔中包被芽孢杆菌、培养基和pH指示剂。加入待测样品并在65℃下培养微孔板，若样品中不含抗生素，孢子生长发育并产酸，降低培养基的pH值，在pH指示剂的作用下，原来的蓝(紫)色将变成黄(绿)色；若样品中含有某种抗生素，孢子的萌芽和发育都将受到抑制，在规定时间内（2 h~3 h），培养基颜色不会发生改变，保持其原有的紫色。

ECLIPSE50微生物抑制法检测液体乳中抗生素残留结果，由表3可见：该方法对于β-内酰胺类抗生素检出限可达4 μg/mL；对于四环素族的抗生素和磺胺类抗生素，其检出限为100 μg/mL。

ECLIPSE50微生物抑制法虽然高于SNAP双流向酶联免疫法，比TTC法依然灵敏许多。ECLIPSE50试剂盒法适用于液体乳中抗生素残留总量的定性检测，该方法无需复杂的样品前处理，只需一步操作且结果直观，而且具备高通量、可在短时间内完成大批量样品筛选的优势，这也是国标TTC法与SNAP双流向酶联免疫法所不能比拟的。但也只是对抗生素的总量的测定，不能系统的分类。比起TTC法，其适用性广泛。TTC法只适用于四环素类、β-内酰胺类和氨基糖甙类的检测。当然，ECLIPSE50试剂盒也较为昂贵，对于普通乳品厂、奶站，以及基层检验机构依然难以承受。

表3 ECLIPSE50微生物抑制法检测结果Table 3 Microbial suppression method ECLIPSE50 testing results

3 结论

自去年“三聚氰胺”及光明“无抗奶”事件之后，乳制品中的抗生素残留日益受到我国政府及社会各界的重视。液态乳中的抗生素残留检测方法众多，其中许多方法已经相当成熟并被写入标准。就本文介绍的三种液态乳中抗生素残留量定性检测方法而言，各有其优势及适用范围。

表4 3种方法对3类抗生素的限量比较Table 4 Three methods of 3 kinds of antibiotics is limited

如表4所示，SNAP双流向酶联免疫法的灵敏度最高，其次是ECLIPSE50微生物抑制法，TTC法检出限及灵敏度较差。β-内酰胺类作为原料乳中最常用的抗生素，此3种方法对其检测灵敏度和精确度相比其他2类抗生素要高。而SNAP双流向酶联免疫法对四环素类和磺胺类的检出限也未及高效液相色谱法高灵敏度[5-6]。但此3种方法的共同特点是操作简单，对实验室及检验人员要求较低。国标TTC法作为国内实验室广泛应用方法，其影响因素大大的局限了实验结果的准确性。SNAP法相对而言精确、灵敏高，但一次性仅能检测单一种类的抗生素，且价格昂贵；ECLIPSE50微生物抑制法具有高通量、可在短时间内完成大批量样品筛选的优势，但也是总量上的检测，同样成本高昂。研究一种经济便捷且能保证检出限及灵敏度的检测方法，用于液体乳中抗生素残留的快速筛选；或是早日实现现有快速检测试剂盒的国产化，以降低检测成本，依然是摆在各相关部门眼前的一项迫切任务。

[1]韦公远，饲料中如何添加抗生素[J].农村养殖技术，2004，5，S8

[2]马兆瑞，祝战斌，卡尔莱·金特.乳与乳制品残留量抗生素的检测方法[J].中国乳品工业，2003，4:37-40

[3]侯亚莉,朱奎,丁双阳.牛奶中抗生素残留检测技术[J].中国乳业，2008(6):56-59

[4]崔小军，王硕.牛奶中残留青霉素类抗生素检测方法的研究进展[J].食品研究与开发，2005，26:113-116

[5]张学炜，侯杰，吕宪禹.反相高效液相色谱法测定牛乳中四环素及土霉素残留量[J].药物分析杂志，2006(5):667-670

[6]胡海燕，徐倩，孙雷，等.猪肉和牛奶中10种磺胺类药物残留检测超高效液相色谱法研究[J].中国兽药杂志,2009(8):1-4,17

[7]马群飞,郭云昌,李瑾,等.GB/T 4789.27-2008食品微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验[S].北京：中国标准出版社，2009：1-3

[8]范立冬，鲁志远.检测鲜乳中残留抗菌素——TTC法的探讨[J].食品科学，1991(7):39-42

[9]吴鹏，赵新淮.应用TTC法检测牛奶中磺胺类残留的试验[J].中国奶牛,2008(7):47-49

Emulsified Rapid Detection of Antibiotic Residues Method of Inquiry

YU Yi，HU Xue-lian，CHAO Qiang-guo，XIONG Wei
（Shanghai Institute Quality Inspection and Technical Research，Shanghai 200233,China）

2010-01-15

俞漪（1978—），女（汉），助工，本科，研究方向：食品中抗生素残留。