一株假单胞菌降解溶解有机氮条件探讨

李军冲，齐树亭，石玉新，焦利卫

（河北工业大学海水高效利用化工技术教育部工程研究中心，天津300130）

一株假单胞菌降解溶解有机氮条件探讨

李军冲，齐树亭*，石玉新，焦利卫

（河北工业大学海水高效利用化工技术教育部工程研究中心，天津300130）

从生长大量藻类的河水中富集氨化细菌，分离优势菌，鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas）菌株，正交试验法确定温度、菌液加入量、曝气时间、pH四因素对假单胞菌溶解有机氮（DON）去除的影响，选用L9（34）正交试验表，以相对空白试验的氨氮增加量为测定指标。结果表明：降解溶解有机氮最佳条件为菌液加入量为2%，温度为28℃，每天曝气时间为6 h，pH为7.0，DON降解率为90.6%。

溶解有机氮；假单胞菌；正交试验；降解

Abstract：Screening ammonibacteria from the river with a large number of algae,a predominant bacteria strain was isolated from the ammonibacteria,the strain was identified as Pseudomonas.The effects of temperature,dosage of pseudomonas,aeration time and pH were studied by orthogonal experimental.Selection of L9（34）orthogonal test,the increasing Ammonia-nitrogen relative blank experent as the examination index.The results showed the optimal conditions of degradating DON were as follows:strain inoculating dosage of 2%,28℃,aerate 6 h each day,pH 7.0,degradation rate of DON reached 90.6%.

Key words:dissolved organic nitrogen（DON）;pseudomonas;orthogonal experiment;degrade

食品工业废水中常含有大量蛋白质、微生物菌体和氮的化合物，对环境的污染严重，尤其会造成水体的富营养化。酿造、发酵和粮食加工的行业，在生产过程中每天都产生大量的有机废水。这些废水大多含有高浓度有机氮，如啤酒、味精、淀粉或豆制品加工所产生的废水中所含有的有机氮是水体富营养化的重要影响因素[1-4]。

采用物理法、化学法、生物法等[5-9]方法降解氨氮、亚硝酸氮等无机氮，已有过大量的研究，而目前主要缺陷是对有机氮参加的循环和反应研究相对很少，对涉及到有机氮的反应过程缺乏了解[10]。

氮元素循环及其环境生态效应研究是长期以来研究的热点领域[11-12]。与无机氮相比，水体中有机氮的研究目前还开展得较少，尤其是对于DON的研究，这是由于水体中的有机氮成分复杂，准确测定有机氮浓度存在困难，目前还只能间接测定[13-14]。有研究表明：DON与无机氮一起参与到水体中最活跃的生物过程，被浮游植物吸收的无机氮有25%～41%以DON的形式释放[10]。河流湖泊等天然水体中溶解有机氮是溶解性总氮的主要组成部分，百分比可达到60%～69%，能迅速被生物利用[15]，和水体内初级生产力息息相关，含有DON废水的排入，是造成水体富营养化的主要因素之一。试验从河水中富集、分离、纯化的氨化细菌，采用正交试验测定降解水体DON的最佳控制条件。并通过空白对照试验测定DON转化成NH3-N的增加比例，确定DON降解程度。

1 材料与方法

1.1 氨化细菌菌源

天津市北运河采集水样，用玻璃纤维滤膜过滤，聚乙烯瓶中储存。

1.2 试剂

蛋白胨、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、琼脂、烯丙基硫脲、龙胆紫染液、碘液、95%乙醇、二氯化汞、氢氧化钠、碘化钾、无氨水等均为分析纯。

1.3 主要仪器与设备

SHA-B型恒温振荡器：常州国华电器有限公司；YXQG02型电热式蒸汽消毒器：山东新华医疗器械股份有限公司；722型光栅分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；SL-CJ-1N医用型洁净工作台：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司北京分公司；XSZ-4G生物显微镜：重庆光学仪器有限公司。

1.4 富集培养基

蛋白胨 5 g，NaCl 0.25 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO40.01 g，蒸馏水 1 L，pH 7.2。

1.5 分离培养基

蛋白胨5g，NaCl0.125g，FeSO40.10g，K2HPO40.15g，MgSO4·7H2O 0.15 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH 7.2。

以10%河水接种于富集培养基，置于培养箱中28℃避光培养，4 d后再以10%培养得到的菌悬液接种到新的富集培养基中，菌液浑浊度明显加大时，将菌液在固体平板培养基上划线分离，将培养皿倒置于28℃恒温箱中进行培养。对单菌落氨化细菌进行液体培养，用分光光度计在660 nm处每天测其吸光度，并用奈氏试剂检验培养液中NH3-N的产生情况，如呈现黄色，说明生成NH3-N，此种细菌可将DON转化为NH3-N，可判断为氨化细菌。

1.6 菌种鉴定

按照文献[16-18]的方法对分离纯化的细菌进行鉴定，经镜检、革兰氏染色及一系列生理生化试验鉴定菌种。

1.7 DON降解正交试验

通过对曝气时间、温度、菌悬液加入量、pH采用四因素三水平正交试验确定降解DON的最佳条件，各因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

1.8 DON检测方法

DON的检测没有直接方法，可采用总氮含量除去无机氮来表示[10]，而无机氮包含氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮等，测定过程繁琐。氨化细菌去除DON原理是将有机氮转化成氨氮，试验用氨氮的生成来表示DON的降解，待测水体中加入烯丙基硫脲[19]抑制氨氮被氧化。氨氮检测采用纳氏试剂法。

2 结果与分析

2.1 菌种鉴定

从分离纯化的菌株中选择一株相对优势菌鉴定，革兰氏染色为阴性，有极生鞭毛，接触酶试验显阳性，氧化酶试验显阳性，能够氧化葡萄糖，鉴定为假单胞菌，编号L125。经纳氏试剂定性检测证明其有降解DON的作用。

分离的L125菌株在摇床中培养，第4天到第5天为对数增长期，第6天后菌液吸光度增长趋势开始明显放缓。

2.2 L125降解DON正交试验结果

选取曝气时间、温度、菌液加入量、pH四因素，将L125菌株放入配制好的人工DON废水，设置不加菌液的空白对照组，在4 d内，各试验组氨氮含量相对空白对照组的增加含量均达到最高值，试验结果见表2。

表2 正交试验结果分析Table 2 Analysis of the orthogonal test data

2.3 极差分析

由表2极差分析得出，温度为影响L125菌株降解水体溶解有机氮的关键因素，四因素主次顺序为：温度＞菌液加入量＞每天曝气时间＞水体pH。采用L125假单胞菌降解水体有机氮最佳组合为A2B2C3D1，最佳条件为30℃，菌液加入量为2%，每天曝气时间为6 h，pH为7.5，所用时间为5 d，和对照试验相比较，氨氮最大增加量为122.69 mg/L。各因素效果图见图1。

由图 1 看出，A3、B2、C3、D2分别为降解有机氮的最佳单因素，故以A3B2C3D2为试验条件，重新测定氨氮增加量，4 d内最高增加量为127.35 mg/L，相比较A2B2C3D1组合，氨氮生成率有所增加，对DON的降解效果变化和第5组相比较相差＜1%，可见最佳菌液用量2%～3%，pH在7.0～7.5之间，但差异并不明显，且D1更为接近自然水体，因此确定A2B2C3D1为降解有机氮的最佳组合。

5 d内L125假单胞菌可达到最佳降解DON效果，并且不会对水体中微生态环境造成破坏。正交试验结束后，继续向第5组试验水体中加入氨化细菌培养液，每天持续测量水体中氨氮含量，新生成氨氮含量在总按氮含量中比例为9.4%。综合考虑认为L125假单胞菌在A2B2C3D1条件下5 d达到降解DON最佳效果，降解率为90.6%。

3 讨论

食品加工过程中产生的蛋白质、氨基酸、微生物菌体等形式中的DON，经微生物的氨化作用，都转化为NH3。既使许多毒性大的有机物得到降解，同时又对代谢积聚的毒物起迁移转化作用，在有机氮水体治理中的脱氮是关键的一步，再通过亚硝化细菌、硝化细菌作用生成NO2-N和NO3-N，最后由反硝化细菌还原成N2。DON的降解使食品加工产生的废水从根本上降低了氮元素的含量，从而减小对天然水体富营养化的影响。

采用静态模拟试验，属非扰动层水体环境，主要利用有机质、铁锰氧化物和硫酸盐作为能量和最终电子受体[20]，利于菌体的生长及DON的去除。正交试验用假单胞菌株L125降解DON的数据结果说明了DON的降解受菌量和试验温度影响，与DON浓度无关，与文献[21]的结论一致，但不同的是，DON的降解还会受到pH和溶解氧的显著影响。DON降解效果与李辉[22]等的结论相比较降解率更高，可能的原因是试验用水体中营养物质差别较大，水体中各种微量元素充足，利于微生物的生长代谢。

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Research on Conditions of Degrading Dissolved Opganic Nitrogen by a Pesudomonas

LI Jun-chong,QI Shu-ting*,SHI Yu-xin,JIAO Li-wei
（Engineering Research Center of Seawater Utilization Technology，Ministry of Education，Hebei University of Technology，Tianjin 300130，China）

2009-11-06

国家“863”计划项目（2002AA648010）

李军冲(1983—)，男（汉），在读硕士研究生，主要从事微生物环境治理研究。

*通讯作者