石榴皮中多酚类物质的提取和组成分析

唐丽丽，刘邻渭，孙丽芳，秦燕，李景景，李璇

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100；2.杨凌职业技术学院生物工程系，陕西杨凌712100）

石榴皮中多酚类物质的提取和组成分析

唐丽丽1,2，刘邻渭1，*，孙丽芳1，秦燕1，李景景1，李璇1

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100；2.杨凌职业技术学院生物工程系，陕西杨凌712100）

采用3种工艺条件提取6种石榴皮中的多酚类物质，测定提取液中总多酚、总黄酮和单宁的含量，以期为石榴皮的功能成分提取和分析方法的优化提供参考。结果显示：3种提取方法对总多酚和总黄酮提取量影响的差异性不显著，而对单宁提取量影响的差异极显著，即70%丙酮、70%乙醇和20%乙醇提取的单宁得率依次增高；石榴皮品种间总多酚、总黄酮和单宁含量的差异都极显著，不同的提取方法和石榴皮品种交互作用对总多酚、总黄酮和单宁的提取得率无显著性影响；3种提取方法所得不同品种石榴皮的提取液中总多酚、总黄酮和单宁含量两两间呈极显著的正相关关系（P<0.01）。

石榴皮；多酚；黄酮;单宁

Abstract：The polyphenols were extracted with three methods from six pomegranate peels and the total polyphenol,total flavonoid and tannin of the extracts were detemined,in order to developing functional food and nutraceutical and optimizing analytical methods.The results showed that:The extraction method did not effected significantly on the extractive yield of total polyphenol and total flavonoid,but of tannin,to which the yields increased gradually with 70%acetone,70%ethanol and 20%ethanol as extactive solvent respectively.The compounds’contents of different peels were different high significantly.The mutual effect between extraction method and variety of peel was no significant impact on the extractive yield.There were significant （P<0.01）linear-correlations among the contents of the three compounds in anyone of the six peels,no matter which extractive method being used.

Key words:pomegranate peel;polyphenol;flavonoid;tannin

石榴（Punica granatum）属于石榴科石榴属落叶灌木或小乔木，主要分布在亚热带及温带地区,是一种营养丰富的珍奇浆果。石榴是国内重点发展的水果之一，陕西临渔、山东枣庄、安徽怀远、四川会理、云南蒙自为我国五大产区。目前，除了加工石榴汁、石榴果酱、石榴酒等食品外，开发石榴皮保健品的研究十分火热。因此，深入研究石榴皮生物活性物质的类别，研究提取物中活性单体的抗氧化和抗诱变机制，以及研究加工、处理和代谢作用对石榴皮生物活性物质的影响，已成为开发新型石榴保健品和药品的关键课题。

石榴皮占石榴的20%～30%，是常用的中药，其性味甘、酸、温、涩而无毒，可以治疗多种疾病。石榴皮主要成分有单宁、蜡、树脂、甘露醇、糖、树胶、菊粉、没食子酸、苹果酸、果胶、草酸钙、生物碱以及异棚皮苷[1]。其中单宁具有收敛、止血、抗菌、抗炎、清除自由基、预防自由基所致的氧化损伤、降血脂作用，以及抑制纤维蛋白溶酶、透明质酸酶、合环氧化酶等多种酶活性的作用[2-5]。

在国内外关于石榴皮研究的基础上，选择了几种主栽品种的石榴皮，采用文献报道的石榴皮总多酚、总黄酮和单宁的最优提取工艺，对6种石榴皮进行了提取试验和得率的分析，比较不同品种石榴皮间总多酚物质、黄酮类化合物和单宁的含量差异，同时研究了不同提取工艺和三类提取物得率之间的关系，以及石榴皮所含三类功能成分含量之间的相关性，以期为石榴皮的功能成分提取、开发利用、以及分析方法的优化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 石榴皮

将陕西临潼产新鲜鲁峪蛋、三白甜、净皮甜、大红酸石榴以及新疆和田产新鲜皮雅曼石榴洗净，除去瓤、籽后于40℃恒温烘干，得到5种干石榴皮，加上市售陕西临潼产混合品种干石榴皮，共得6种石榴皮（分别记为A1、A2…A6）。分别粉碎后过40目筛，粉末贮于广口瓶中避光备用。

1.1.2 试剂

没食子酸标准品、芦丁标准品、Folin-Ciocalteu试剂、7.5%Na2CO3溶液、无水乙醇、10%Al3（NO3）溶液、5%NaNO2溶液、1 mol/L 乙酸锌溶液、氨水、EDTA·2Na、铬黑T指示剂等皆为市售分析纯试剂，并用蒸馏水或其他溶剂按要求配制。

1.1.3 主要仪器

JA2003电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；UV-1700型分光光度计：日本岛津公司；SC-2546低速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司；DHG-9030A电热恒温干燥箱：上海精宏实验设备有限公司：KQ-600DB型超声波清洗器:昆山超声仪器有限公司；R-210型旋转蒸发仪：瑞士Bü CHI公司。

1.2 试验方法

1.2.1 石榴皮提取物的制备

1）提取方法一（记为 B1）：参考贾冬英[6]等的提取工艺。简言之，以体积分数20%的乙醇为提取剂，料液比为1∶20，50℃下回流提取，一次回流提取时间为1 h。

2）提取方法二（记为 B2）：参考吕琴[7]和陈红梅[8]等的提取工艺。简言之，以体积分数70%的乙醇为提取剂，料液比为1∶20，80℃下回流提取，一次回流提取时间为3 h。

3）提取方法三（记为 B3）：参考任平[9]等的提取工艺。简言之，以体积分数70%的丙酮为提取剂，料液比为1∶20，60℃下回流提取，一次回流提取时间为3 h。

4）提取步骤：准确秤取2.000 g石榴皮粉置于圆底烧瓶中，分别按提取方法一、二、三相应条件进行操作，回流提取均为3次，抽滤，合并滤液。每个处理做3次重复。

说明：通过预试验可知，按4）进行3次回流提取后，分别测定每次提取液的总多酚、总黄酮和单宁含量。结果说明，第三次提取得率仅约为第一次提取得率的七分之一。因此，本研究将3次提取所得的总多酚、总黄酮和单宁近似看作为它们在样品中的含量。

1.2.2 石榴皮中总多酚含量测定

1.2.2.1 没食子酸标准曲线的制作

将0.11 g一水合没食子酸加水溶解并定容到100 mL容量瓶中，得1000 mg/L一水合没食子酸标准溶液。分别精确吸取此溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于100 mL容量瓶中，加入蒸馏水稀释至刻度，此时溶液浓度分别为 0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L。

分别吸取上述没食子酸溶液1.0 mL于10 mL具塞试管中，以蒸馏水为空白对照，然后，依次加入Folin-Ciocalteu试剂（加水稀释1倍后的）0.5 mL，摇匀，然后加入7.5%碳酸钠溶液4 mL，蒸馏水定容至10 mL，充分混匀后在室温下避光静置30 min，于760 nm处测定样品吸光值，重复2次，取平均值。

将平行测定结果的平均值进行线性回归，得没食子酸含量（X）与吸光值（Y）之间的直线方程，见图1。样品中总酚含量以没食子酸含量表示[10]。

1.2.2.2 石榴皮中总多酚含量的测定

将三次提取液合并后，用蒸馏水定容，按照标准曲线制作步骤进行显色后在760 nm下测定吸光度，再按照标准曲线方程计算定溶液中总多酚含量，最后换算成参试石榴皮总多酚含量。

1.2.3 石榴皮中总黄酮类物质含量测定

1.2.3.1 芦丁标准曲线的制作[11]

准确称取40℃烘干恒重的芦丁标准品0.10 g，用95%的乙醇溶解后转入50 mL容量瓶中，并定容，得芦丁储备液。取5 mL芦丁储备液移入50 mL容量瓶中并用40%乙醇稀释定容，得芦丁工作液。分别精确吸取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、4.5 mL 芦丁工作液于 10 mL 具塞试管中，以40%乙醇为空白对照，分别加入5%亚硝酸钠0.3 mL后放置6 min，再分别加入10%硝酸铝0.3 mL，再放置6 min，随后各试管加入4%氢氧化钠溶液4 mL，最后用40%乙醇补充到10 mL，静置15 min，于507 nm处测吸光值，重复2次，取平均值。

将平行测定结果的平均值进行线性回归，得芦丁浓度（X）与吸光值（Y）之间的直线方程，见图2。样品中黄酮含量以芦丁含量表示。

1.2.3.2 石榴皮中总黄酮含量的测定

将先后3次的提取液合并后加水定容，按照标准曲线制作步骤进行显色后在507 nm下测定吸光度，重复2次取平均值，再按照标准曲线方程计算定容液的总黄酮含量，最后换算成参试石榴皮总黄酮含量。

1.2.4 石榴皮中单宁类物质含量测定

测定单宁采用络合法[9]。具体方法如下：

将3次提取液合并后加水定容至200 mL，量取50 mL提取液液温（20±1）℃移入500 mL烧杯中，加水至约 300 mL，置（30±2）℃水浴中预热，精确量取1 mol/L乙酸锌溶液20 mL，置于500 mL容量瓶中，加入14 mL氨水摇匀，使白色沉淀溶解，缓慢将预热后的溶液移入容量瓶中，边移入边振荡，移毕继续振摇1 min后，置于原水浴保温30 min并间歇振摇数次，待反应完毕，加水定容，取适量定溶液于3000 r/min离心5 min，取上层清液再于3500 r/min离心10 min，精确量取20 mL上层清液转于锥形瓶，加300 mL蒸馏水、25 mL氯化铵+氨水缓冲液（pH＝10）和1 mL铬黑T指示剂溶液，以0.05 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液滴定至溶液由酒红色变为暗蓝色，并用空白校正，重复滴定两次，滴定结果取平均值。按照1 mL乙酸锌（1 mol/L）消耗单宁 0.1446 g计，石榴皮中单宁类物质含量计算公式如下：

式中：CZn为醋酸锌标准溶液物质的量浓度，（mol/L）；CEDTA为EDTA·2Na标准溶液物质的量浓度，（mol/L）；V为校正后的EDTA·2Na标准溶液滴定消耗量，mL；G为石榴皮粉样品的质量，g；X为石榴皮粉样品的含水量，%。

1.3 数据分析与统计

试验数据利用Excel 2003数据分析工具进行处理。分别进行双因素有重复方差分析，并用新复极差法（SSR法）检验各处理平均数之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 多酚类物质含量测定结果

对6种不同石榴皮粉用以上3种方法进行提取，测定提取液中的总多酚、总黄酮以及单宁的含量，结果见表1。

表1 3种方法提取不同品种石榴皮的多酚类物质含量的测定结果（x±s）Table 1 The pomegranate peel polyphenols contents of different species extracted with different method mg/g

2.2 方差分析与多重比较

2.2.1 提取方法对石榴皮总多酚含量测定结果的影响

2.2.1.1 方差分析

对3种提取方法得到的6种石榴皮粉总多酚含量进行方差分析的结果见表2。从表中可以看出3种提取方法以及提取方法和石榴皮品种的交互作用对总多酚提取量影响的差异性不显著，而不同的石榴皮品种间总多酚含量的差异性极显著。

2.2.1.2 多重比较

用SSR法对6种石榴皮进行总多酚含量平均数间的多重比较，结果见表3。

表2 石榴皮总多酚含量测定结果方差分析表Table 2 Variance analysis of total polyphenol content in pomegranate peels

表3 石榴皮品种间总多酚含量均数多重比较结果（SSR法）Table 3 The multiple comparisons of total polyphenol's average contents of different pomegranate peels（SSR）

表明在α=0.05和α=0.01水平下A2和A6差异不显著，即三白甜与混合皮粉的总多酚均数差异不显著，其余品种两两间总多酚含量差异都极显著。

2.2.2 提取方法对石榴皮总黄酮含量测定结果的影响

2.2.2.1 方差分析

对3种提取方法得到的6种石榴皮总黄酮含量进行方差分析的结果见表4。

表4 石榴皮总黄酮含量测定结果的方差分析表Table 4 Variance analysis of total flavonoid content in pomegranate peels

与2.2.1中对总多酚的方差分析结果相似，3种提取方法以及提取方法和石榴皮品种的交互作用对总黄酮的提取量影响的差异性不显著，而不同的石榴皮品种间总黄酮含量的差异性极显著。

2.2.2.2 多重比较

用SSR法对不同石榴皮总黄酮含量平均数间进行多重比较，结果见表5。

表5 石榴皮品种间总黄酮含量均数多重比较结果（SSR法）Table 5 The multiple comparisons of total flavonoid's average contents of different pomegranate peels（SSR）

表明在 α=0.05 水平下，三白甜（A2）与混合皮（A6）差异不显著，其余品种间总黄酮含量差异都显著；在α=0.01水平下，净皮甜（A4）和三白甜（A2）的总黄酮含量差异不显著，同时三白甜（A2）、混合皮（A6）和大红酸（A3）三者间的总黄酮含量差异也不显著，其余品种两两间总黄酮含量均数差异极显著。

2.2.3 提取方法对石榴皮单宁含量测定结果的影响

2.2.3.1 方差分析

对3种提取方法得到的6种石榴皮单宁含量进行方差分析的结果见表6。

表6 石榴皮单宁含量测定结果方差分析表Table 6 Variance analysis of tannin contents in pomegranate peels

从表6中可以看出提取方法和石榴皮品种的交互作用对单宁的提取量影响差异性不显著，而3种提取方法对于单宁的提取量影响的差异性以及不同的石榴皮品种间单宁含量的差异性极显著。

2.2.3.2 多重比较

①品种间单宁含量的多重比较

用SSR法对不同品种间石榴皮单宁含量平均数进行多重比较，结果见表7。

表明在 α=0.05和 α=0.01水平下，三白甜（A2）与净皮甜（A4）单宁含量均数间差异不显著，其余品种两两均数间差异都极显著。

②不同提取方法所得单宁提取量间的多重比较

对不同提取方法所得单宁提取量平均数间进行多重比较的结果见表8。

表7 石榴皮间单宁含量均数多重比较结果（SSR法）Table 7 The multiple comparisons of tannin's average contents of different pomegranate peels（SSR）

表8 提取方法间所得单宁提取量均数的多重比较结果（SSR法）Table 8 The multiple comparisons of tannin's average contents of different extraction methods（SSR）

表明提取方法B1与B3、B2与B3所得单宁提取量间的差异极显著，提取方法B1与B2所得单宁提取量间的差异显著。

2.3 石榴皮中不同类多酚化合物含量的相关性分析

分别对3种不同提取方法从6种石榴皮中得到的总多酚、总黄酮和单宁含量进行相关性分析，结果见表9。

表9 三种方法提取的总酚、总黄酮和单宁含量间的相关系数Table 9 The correlation coefficients between total polyphenol,total flavonoid and tannin contents based on three methods

表中相关系数表明，不论采用哪种提取方法，从任何一种石榴皮得到的总多酚、总黄酮和单宁含量两两之间的相关性极显著（P<0.01）。

3 结论

1）3种提取方法对总多酚、总黄酮提取量的影响差异不显著，而对于单宁提取量的影响差异极显著，单宁提取溶剂的优劣顺序为：20%乙醇优于70%乙醇优于70%丙酮；石榴皮品种间总多酚、总黄酮和单宁的含量差异极显著，6种石榴皮总多酚和总黄酮的含量次序为：鲁峪蛋>净皮甜>三白甜>混合皮>大红酸>皮雅曼，单宁的含量次序为：鲁峪蛋>三白甜>净皮甜>混合皮>大红酸>皮雅曼；不同的提取方法和石榴皮品种的交互作用对总多酚、总黄酮和单宁的提取量差异性不显著。

2）三种提取方法所得不同品种石榴皮提取液中的总多酚、总黄酮和单宁含量两两间呈极显著的正相关关系（P<0.01）。

4 讨论

1）从研究结果可知，无论采用那种提取方法，如果采用3次较长时间的提取，石榴皮中总多酚和总黄酮的提取均可达到较为完全，因此提取方法对于总多酚和总黄酮的提取效果影响无显著差异；不同提取方法对单宁的提取量却有显著影响，其中提取方法1（B1）提取单宁的效果最好。在不同提取剂对单宁的提取效果方面，本文的试验结果和任平等[9]的研究结果不同，这是因为，在比较不同提取剂的提取效果时，本研究采用的提取次数均为3次，每次都用了足够长的时间，而其他人采用的提取次数仅为一次，每次所用的时间并未报道，所以，应该说本文和他人所得的结果分别反映了不同提取剂对单宁提取效果影响的不同方面。

2）通过相关性分析可知，同一种方法从石榴皮中提取的总多酚、总黄酮和单宁的含量分析结果间始终存在着高度相关性。所以，在石榴皮多酚类物质提取工作中进行提取结果的测定时，可以选择其中一类最易测定的多酚化合物进行跟踪测定，而其他两类多酚化合物的含量可以凭借这种高度相关性进行估测。这种高度的相关性未见前人报道，因此本结果的发现应对减轻测定工作量具有较高参考价值。

3）不同石榴皮品种间的各类多酚物质的含量间具有显著差异，这一结果未见前人报道。因此，这一发现提示在开发石榴皮保健食品的过程中应当注重石榴皮品种的选择。

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Pomegranate Peel Polyphenols Extraction and Analysis

TANG Li-li1,2,LIU Lin-wei1,*,SUN Li-fang1,QIN Yan1,LI Jing-jing1，LI Xuan1
（1.College of Food Science and Engineering，Northwest A＆F University，Yangling 712100，Shaanxi，China；2.Yangling Vocational＆ Technical College，Yangling 712100，Shaanxi，China）

2009-11-16

唐丽丽（1982—），女（汉），助教，硕士研究生，研究方向：食品化学。

*通讯作者：刘邻渭，教授，博士生导师。