骨髓间充质干细胞移植修复大鼠半横断脊髓损伤

吴金生,董爱萍,王晓萃,魏志新,刘伟光,栾志敏,祝增军

(1.山东潍坊医学院附属医院泌尿外科,山东潍坊 261053;2.潍坊蓝天医院,山东潍坊 261042; 3.潍坊医学院人体解剖学教研室,山东潍坊 261053;4.潍坊医学院形态学实验室,山东潍坊 261053)

研究报告

骨髓间充质干细胞移植修复大鼠半横断脊髓损伤

吴金生1,董爱萍2,王晓萃3,魏志新4,刘伟光1,栾志敏1,祝增军1

(1.山东潍坊医学院附属医院泌尿外科,山东潍坊 261053;2.潍坊蓝天医院,山东潍坊 261042; 3.潍坊医学院人体解剖学教研室,山东潍坊 261053;4.潍坊医学院形态学实验室,山东潍坊 261053)

目的 初步探讨骨髓间充质干细胞诱导为神经细胞,及其移植对大鼠脊髓半横断损伤神经功能恢复和运动的影响。方法贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(m esenchym al stem cells,M SCs),大鼠脊髓匀浆上清诱导第3代向神经细胞分化,经免疫组化鉴定分化后细胞的性质。制备大鼠半横断脊髓损伤模型,脊髓损伤局部注射B rdU标记诱导后的神经细胞。细胞移植5周后观察移植细胞在脊髓内存活分布情况。结果倒置显微镜下可见M SCs呈纺锤形和多角形,有1～2个核仁,经脊髓匀浆上清诱导后,发出数个细长突起,并交织成网,诱导后的细胞表达Nestin,可推测诱导后的细胞为M SCs源神经细胞。5周后移植的M SCs在宿主损伤脊髓内聚集并存活,表达MAP-2、NF、GFAP与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。大鼠运动功能较移植前有所改善。结论M SCs经脊髓匀浆上清诱导后移植治疗大鼠半横断脊髓损伤可使运动功能得到改善。

间充质干细胞;脊髓损伤;诱导分化;细胞移植;大鼠

脊髓损伤(sp inal cord in jury,SC I)是常见的严重创伤,脊髓损伤发生后,损伤部位的神经轴突被撕裂,神经元和神经胶质细胞死亡,幸存的轴突发生脱髓鞘改变,这些最终导致脊髓丧失传导下行的运动冲动和上行的感觉冲动的能力,患者发生瘫痪。长期以来,SC I的治疗一直是一个难题。骨髓间充质干细胞(m esenchym al stem cells,M SCs)是另外一种多功能干细胞,具有多潜能性,M SCs不仅可分化为中胚层的骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞,而且能分化成外胚层的神经元、神经胶质细胞及内胚层的肝细胞[1-3]。因此利用M SCs的横向分化潜能,根据需要将其诱导分化为特定的组织细胞,用以修复受损的组织或器官。脊髓损伤、多发硬化症、帕金森病和阿尔茨莫病都是可以用M SCs代替破坏或者无功能的细胞来进行治疗的中枢神经系统疾病,因此用干细胞替换组织或细胞治疗神经系统疾患逐渐成为研究的主要焦点。

1 材料与方法

1.1 主要动物、仪器及试剂

健康Sp rague-Daw ley(SD)大鼠,体质量200～220 g,雌雄不拘,军事医学科学院【SCXK(军)2002-001】。Thermo CO2培养箱(美国),倒置相差显微镜(日本O lympus),激光共聚焦显微镜(LS M 5 Pascal)德国Zeiss公司,S W-CT-1FD超净工作台(中国), Labofuge-300低速离心机(德国),L-DM EM(美国Gibco),胎牛血清(杭州四季青生物有限公司),胰蛋白酶(美国Sigm a),nestin、MAP-2(兔抗大鼠微管相关蛋白,北京中杉生物技术公司),NF(兔抗大鼠神经丝蛋白,福建迈新生物技术公司公司)胶质纤维酸性蛋白(GFAP,北京中杉生物技术公司),B rdU (美国Sigm a公司),兔抗鼠B rdU二抗(北京中杉生物技术公司),羊抗兔TR ITC(北京中杉生物技术公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓M SCs的分离、培养和传代[4]:健康SD大鼠,颈椎脱臼处死,无菌条件下完整取出胸椎-腰椎节段脊髓,立即用4℃预冷PBS洗去血迹,置于5 mL 4℃PBS液中进行匀浆、离心(2 000 r/m in,10 m in),取上清液先用200目网筛过滤,再用0.2μm的针头滤器过滤,-20℃下冷冻保存备用。

1.2.2 脊髓匀浆诱导后细胞免疫组化鉴定:覆有诱导细胞的盖玻片用0.01 mol/L PBS洗涤3次,后用4%中性甲醛固定30 m in,PBS洗涤,过氧化物酶阻断,非免疫动物血清孵育30 m in,加NSE、NF抗体,4℃过夜,加入生物素标记的第二抗体,链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液,DAB溶液显色,苏木素复染,中性树胶封固,在显微镜下观察。细胞免疫组化染色后光镜下随机数取10个非重叠视野(×100),计算nestin、NF阳性细胞分别占总细胞数的比例。

1.2.3 脊髓损伤动物模型的建立:水合氯醛(30 m g/kg)腹腔注射麻醉,以TS棘突为中心取背部后正中切口长约5 cm,显露T7-T11棘突及椎板。咬除T9棘突及全椎板,11号尖刀片在左侧造成脊髓半横断模型。术后缝合。图1、2(彩插7)。

1.2.4 细胞移植及组织学观察:M SCs移植组使用微量注射器约45度斜角(针头斜面向下)将经B rdU标记的M SCs细胞悬液缓慢注入到脊髓半切头侧和尾侧损伤临近区域的灰白质交界处(距脊髓表面约0.7 mm),总细胞数6×105细胞,注射时间10 m in,留针5 m in,医用生物蛋白胶封闭注射孔。对照组依同样方法注射等量PBS缓冲液。手术或细胞移植后72 h、7 d、5周灌注固定观察移植后细胞存活情况。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠骨髓M SC s的形态特点

采用贴壁培养法培养大鼠骨髓M SCs。培养24 h,部分细胞贴壁生长,随后有微小突伸出,悬浮于培养液中的红细胞随换液减少。培养7 d后,细胞不断分裂增殖,形成明显的细胞集落。培养10～14 d,细胞贴满瓶底,呈梭形,待细胞生长至80%融合时进行传代。传代后的细胞24 h即贴壁、伸展为三角形、多角形,并逐渐变成短梭形、长梭形,胞质丰富,细胞核圆形,体积较大,可见到明显的核仁(图3A)。

2.2 大鼠脊髓匀浆上清液诱导后细胞的形态变化

诱导24 h,细胞形态逐渐变成细长梭形,排列规则。48 h细胞形态逐渐出现改变,胞体折光性强,相互交织,类似神经细胞样(图3B)。对照组细胞形态则未见明显变化。经脊髓匀浆上清诱导48 h后,大多数细胞表现为nestin阳性,胞质着红色荧光,诱导72 h阳性表达加强(图3C);诱导前细胞不表达nestin。

2.3 细胞移植后激光共聚焦显微镜、免疫组织化学观察

M SCs源神经细胞移植后,共聚焦显微镜下观察带有荧光标记的B rdU细胞散在分布于脊髓内,细胞核着红色,呈圆形、椭圆形(图3D)。移植后脊髓免疫组织化学染色:MAP-2阳性反应定位于神经元的胞质,呈棕黄色(图3E),移植后NF神经细胞胞质内棕黄色颗粒高表达(图3F),GFAP表达阳性,细胞质内阳性着色(图3G)与移植前阳性细胞数对比差异有显著性(P<0.05)。见表1。

表1 术后5周各组切片M ap-2、GFAP阳性细胞数变化(±s,n=6)Tab.1 Changes ofM ap-2-and GFAP-positive cells at 5 weeks after treatm ent.(±s,n=6)

表1 术后5周各组切片M ap-2、GFAP阳性细胞数变化(±s,n=6)Tab.1 Changes ofM ap-2-and GFAP-positive cells at 5 weeks after treatm ent.(±s,n=6)

注:各组间均有差异,有统计学意义P<0.05Note:There are significant differences among the group s,P<0.05

组别Group MAP-2 GFAP对照组Control 16.3±4.5 17.5±3.0模型组Model 30.2±5.5 37.6±4.8 MSCs移植组61.2±3.5 65.9±3.63 Transp lantation

2.4 大鼠脊髓损伤行为学观察

大鼠在术后8 h完全清醒,所有受试鼠均出现脊髓休克综合征,采用BBB评分标准,术后3～4 d活动减少,饮食减少,尿储留。细胞移植术3～4 d,饮食增加,活动增加,整个肌张力恢复过程:1～4 d迟缓性瘫,双后肢拖行,5～8 d痉挛性瘫;8～12 d双下肢恢复少量活动;12～16 d双后肢活动逐渐恢复(表2)。

表2 M SCs移植术后各组大鼠行为评分(±s)Tab.2 The behavio ral scores after transp lantation in the rats of various groups.(±s)

表2 M SCs移植术后各组大鼠行为评分(±s)Tab.2 The behavio ral scores after transp lantation in the rats of various groups.(±s)

注:移植后与移植前行为学差异有显著性,P<0.05Note:There were significant differences in the rat behavior before and after transp lantation.P<0.05

组别Group术后1 d 1 day after trasp lantation术后7 d 7 days after transp lan -tation术后14 d 14 days after transp lantation模型对照组Contro lmodel 2.44±2.40 5.13±3.36 9.13±4.55 M SCs移植组Transp lantation 2.50±2.67 10.71±6.24 15.00±6.60

2.5 超微结构观察

电镜观察移植前后组织超微结构的变化:移植前脊髓灰质大部分神经元坏死,胞膜不完整,胞质内部分细胞器崩解,白质内,轴索萎缩,水肿,坏死,髓鞘增厚或脱髓现象(图3H);移植后脊髓灰质部分神经元坏死,核内染色质溶解胞膜不完整,部分神经元结构尚可,胞质内线粒体发达,有些区域可见胶质细胞增生,白质内有髓神经纤维结构尚可,轴索结构完整(图3 I)。图3见彩插8。

3 讨论

3.1 骨髓M SC s向神经元的诱导分化及鉴定

越来越多的研究结果表明骨髓M SCs具有多向分化潜能,它不仅可分化为中胚层来源的细胞,而且具有向神经细胞分化的潜能[5]。W oodbury等[3]用BM E、DM SO和丁羟基茴香醚(BHA)等具有还原性的物质将M SCs诱导成为神经元,也有学者[6]采用表皮生长因子(EGF)或脑源性神经生长因子(BDNF)与视黄酸的组合。联合应用异丁甲基黄嘌呤( IBMX)和二丁基环磷酸腺苷(dbcAM P)提高细胞内cAM P的含量,亦可将M SCs转变为神经元样细胞[7]。有报道将M SCs与海马脑片共同培养后, M SCs可分化为神经元样细胞,表明在这两种细胞共培养的过程中神经元可以提供给M SCs分化所必需的神经营养因子和细胞因子,此外,细胞间的相互接触在M SCs向神经元的分化过程中发挥着重要的作用[8]。我们在以往的实验中采用脑匀浆上清作为诱导剂将M SCS诱导为神经细胞取得了很好的效果[4]。为了更好地模拟M SCs在脊髓的生长分化情况,本实验采用脊髓匀浆上清液作为生物性诱导剂诱导M SCs向神经元的分化,诱导后的细胞均表达神经元的特异性标志物NSE和nestin,不表达星形胶质细胞的标志物GFAP,且均具有神经元的特有结构—尼氏体,由此证明此方法均可将大鼠骨髓M SCs诱导分化为神经元而不是星形胶质细胞。

3.2 脊髓损伤动物的细胞移植疗法

Harvey等[9]研究认为M SCs移植支持SC I后血管神经再生和神经网络的重建。M SCs细胞移植的方法很多,李进领等[10]观察M SCS通过静脉与腹腔不同移植方法对脊髓损伤修复,细胞迁移途径进行观察,发现静脉移植优于腹腔移植,尾静脉注射的M SCs在损伤部位较未损伤部位明显增多。冯大雄等[11]研究发现,脊髓损伤后静脉注射M SCs 2、3、6周后,在损伤灶及其邻近的损伤带中可检测到存活的M SCs,表明M SCs可通过血脑屏障,在脊髓内未见新生肿瘤的形成。A kiyam a等[12]将M SCs直接注射入SC I模型鼠脊髓后发现在再损伤的中心有明显的髓鞘再生现象,损伤的边缘也有部分髓鞘再生现象。骨质疏松是SC I的常见并发症。李颖智等[13]研究发现脊髓损伤大鼠易发生骨质疏松症,损伤平面上下骨质均受累,骨质疏松后骨细胞超微结构改变显著,但不同部位改变程度不同,以损伤平面以下骨质受累较重。因此要及时治疗脊髓损伤防止并发症的发生。我们的实验中直接将诱导标记后的细胞移植入脊髓损伤处,这样既不能造成细胞的流失也增加损伤处的细胞量,移植后脊髓损伤动物在组织学和行为学的层次都有明显改善。对移植前后大鼠脊髓超微结构观察可见移植前脊髓灰质大部分神经元坏死,胞膜不完整,胞质内部分细胞器崩解,白质内,轴索萎缩,水肿,坏死,髓鞘增厚或脱髓现象;移植后脊髓灰质部分神经元坏死,核内染色质溶解胞膜不完整,部分神经元结构尚可,胞质内线粒体发达,有些区域可见胶质细胞增生,白质内有髓神经纤维结构尚可,轴索结构完整。脊髓损伤鼠在细胞移植术后3～4 d,饮食增加,活动增加,整个肌张力恢复过程:1～4 d迟缓性瘫,双后肢拖行,5～8 d痉挛性瘫;8～12 d双下肢恢复少量活动;12～16 d双后肢活动逐渐恢复。通过免疫组织化学和行为学观察,表明M SCs细胞移植后能够在脊髓内存活,而且脊髓损伤大鼠的运动功能有所改善。

目前,在细胞移植治疗SC I的领域中还有许多问题亟待解决:①如何引导轴突向合适的目标方向生长,进而建立功能联系的机制还不清楚。②如果缺乏充足的营养,M SCs在移植部位寿命有限。③即使是自体移植的M SCs在分离培养扩增过程中会导致分泌细胞因子及合成表面受体能力下降,从而失去趋化、支持、营养等功能,甚至失去干细胞特性。随着基础研究、临床实验成果和经验的不断积累,M SCs极有可能在脊髓损伤治疗这一世界难题中发挥不可替代的作用。

(本文图1,2见彩插7,图3见彩插8)。

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Bone M arrow M esenchym a l Stem Cell Tran sp lan ta tion in the Repa ir of Ra t Sp ina l Cord Hem isection In jury

WU Jin-sheng1,DONGA i-p ing2,WANG X iao-cui3,W EI Zhi-xin4,L IU W ei-guang1,LUAN Zhi-m in1,ZHU Zeng-jun1
(1.Departm ent ofU ro logy,A ffiliated Hosp ital ofW eifangM edical Co llegeW eifang 261053,China; 2.Lantian Hosp ital,W eifang 261042;3.Departm ent of Hum an Anatom y; 4.Labo ratory ofMorpho logy,W eifangM edical Co llege,W eifang 261053)

O b jective To investigate the differentiation of bone m arrow-derived m esenchym al stem cells into neurons and transp lantation of the stem cells to repair rat hem isection sp inal co rd in jury.M ethods Adherent cu lture was used to isolate and cu lture rat bone m arrow m esenchym al stem cells(M SCs).The rat sp inal cord homogenate supernatant was used to induce neural differentiation of the 3 rd generation cells.The nature of cell differentiation w as identified by imm unohistochem istry.The ratmodel of hem isection sp inal co rd in ju rywas p repared and B rdU was locally in jected to label the induced neurons.The distribution of living cells in the in juried sp inal cord was observed at 5 weeks after cell transp lantation.ResultsM SCswere sp ind le and po lygonal,w ith 1-2 nucleo li seen under the inverted m icroscope.A fter induction w ith sp inal cord homogenate supernatant there were a num ber of slender cytop lasm ic p ro jections form ing inter w ined netwo rk and show ing nestin exp ression,therefo re,indicating the neuronal nature.M SCs at 5 weeks after transp lantation into the sp inal cord in jurywere surviving and their exp ression ofMAP-2,NF,GFAPwas significantly higher than that in the control rats(P<0.05).The ratmotor function was imp roved than before transp lantation.Conc lusion M SCs induced by sp inal cord homogenate supernatant can be transp lanted into hem isection sp inal cord in jury and imp rove the motor function of the in juries lesions.

Bone m arrow;M esenchym al stem cells;Sp inal co rd inju ry;Induced differen tiation;Cell transp lantation;Rat

R651.2

A

1005-4847(2010)01-0056-04

2009-04-13

山东省潍坊市科学技术局资助项目(编号:200703035)。

吴金生,男,主治医师,硕士学位.研究方向:干细胞诱导分化及移植。E-mail:w js w fm c@163.com