5-脂氧化酶转基因小鼠模型的制备

张梅英,吴红联,杨葳,李兆阳,董婉维,周生来,于洋,王惟,吕相川,秦英,郑志红,王禄增

(中国医科大学实验动物学部,沈阳 110001)

5-脂氧化酶转基因小鼠模型的制备

张梅英,吴红联,杨葳,李兆阳,董婉维,周生来,于洋,王惟,吕相川,秦英,郑志红,王禄增

(中国医科大学实验动物学部,沈阳 110001)

目的 建立5-脂氧化酶(5-LO)转基因小鼠进行动脉粥样硬化的发病分子机制的研究。方法通过显微注射的方法,将5-脂氧化酶基因片段(6.8 kb)导入BDF1受精卵雄原核并移植到同期受孕的假孕母鼠输卵管中,对产出仔鼠的鼠尾组织DNA进行PCR、Southern b lot检测,对9、20、24号转基因小鼠分别提取腹腔细胞、骨髓细胞及脾、肾组织总RNA和蛋白,并采用RT-PCR、W estern b lot方法进行转录水平检测和蛋白表达检测。结果共产生25只子代小鼠,经PCR和Southern检测获得7只阳性小鼠,经RT-PCR和W estern b lot检测结果表明,9、20、24号转基因小鼠腹腔细胞、骨髓细胞、脾、肾5-LO和5-脂氧化酶激活蛋白(FLAP)在RNA和蛋白水平表达均高于正常BDF1对照小鼠,且统计学分析腹腔细胞、骨髓细胞表达均具有显著差异(P<0.05)。结论成功建立5-LO转基因小鼠模型。

5-脂氧化酶;动脉粥样硬化;转基因

动脉粥样硬化症(atherosc lerosis,AS)是危害人类健康的常见重要疾病,目前AS已被公认亦是一慢性炎症性疾病[1-4],自2002年来,日益增多的证据表明5-脂氧化酶(5-lipoxygenase,5-LO)及其衍生物白三烯族(leukotrienes,LTs)炎性介质参与了AS发生的炎症反应形成过程[5-7]。但是,5-LO过表达导致AS发生的炎症反应机制目前并不完全清楚,为此,我们拟建立高表达5-LO的转基因小鼠,通过该模型进一步阐明5-LO过表达与AS发生发展的关系。

1 材料和方法

1.1 实验动物

BDF1小鼠(C57BL/6×DBA/2)、ICR小鼠为SPF级实验动物【SCXK(京)2002-0003】,均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。饲料购自北京科澳协力饲料有限公司【SCXK(京)2005-0007】。饮用水为高压酸化水(pH 2.5～3)),动物饲养于12h明暗循环的屏障系统内。实验过程中对实验用鼠均按照实验动物的3R原则给予人道关怀。

1.2 菌种与质粒

感受态DH5α大肠杆菌(E.co li)由本室保存; pEGFP-5LO质粒由美国哈佛大学金壮教授惠赠。

1.3 试剂与设备

M 2、M 16培养液、透明脂酸酶、矿物油购自Sigm a公司,限制性内切酶、PCR片段纯化试剂盒、DNA小量提取试剂盒为大连宝生物工程公司产品, Q IAquick gel extraction kit为Q iagen公司产品,PCR引物、Trizo l RNA试剂盒为Invitrogen产品,5-LO和5-脂氧化酶激活蛋白(FLAP)抗体为Chem icon公司产品。孕马血清(PM SG)为宁波市激素制品厂生产,人绒毛膜促性腺激素(hCG)为上海生物化学制药厂生产,其他试剂为国产优质纯级。

倒置相差显微镜和显微操作系统为O lympus I X71型、注射泵为Eppendorf公司产品,拉针仪和煅烧议为Narishige公司出品,G-1硝子管和GD-1硝子管购于尼康公司,其他仪器包括解剖显微镜、二氧化碳培养箱和常规手术器械。

1.4 显微注射目的片段的纯化

用Stu I对pEGFP-5LO质粒进行单酶切,1%琼脂糖凝胶电泳回收目的片段,用Q IAquick gel extraction kit试剂盒纯化回收约6.8 kp片段。纯化后DNA以约3 ng/μL的浓度溶解于m icroinjection buffer(5 mmo l Tris pH 7.4,0.1 mmo l EDTA)中, -20℃保存备用,用于显微注射。

1.5 转基因小鼠的制备

将上述纯化的5-脂氧化酶与GPF融合蛋白基因片段用显微注射法注入BDF1小鼠受精卵雄原核中,将注射后存活的受精卵移植到I CR假孕母鼠双侧输卵管,待产。

1.6 转基因小鼠的检测

1.6.1 鼠尾组织基因组DNA的抽提:剪取出生15 d后的小鼠尾组织0.5～1 cm,55℃蛋白酶K消化过夜,常规酚/氯仿法抽提DNA,4℃贮存备用。

1.6.2 转基因小鼠PCR检测:根据pEGFP-5LO质粒中GFP与5-LO基因序列设计并合成引物,预计扩增片段长度为900 bp;引物序列为:p1:5′-TCCAGGAGCGCACCATCTTC-3′;p2:5′-TGCCGT GTTTCCAGTTCTTTAC-3′,PCR反应条件为:预变性温度:95℃5 m in,变性温度:94℃50 s,退火温度:55℃50 s,延伸温度:72℃50 s,33循环,72℃10 m in。用1%琼脂糖凝胶电泳进行扩增产物的分析。PCR反应体系为50μL,取1μL基因组DNA为模板。

1.6.3 转基因小鼠Southern blot检测:PCR检测阳性转基因小鼠及阴性对照BDF1小鼠基因组DNA (约30μg)Eco R I 37℃水浴过夜酶切,1%琼脂塘凝胶100 V电泳2 h,凝胶处理后采用毛吸印迹法尼龙膜{带正电}转移DNA,GFP与5-脂氧化酶基因PCR扩增产物为探针并采用DNA凝胶回收试剂盒纯化探针,α-32P同位素标记探针。

1.6.4 转基因小鼠RNA水平表达检测:分别选取9、20、24号F0代转基因小鼠,采用Trizo l RNA试剂盒提取腹腔细胞、骨髓细胞及脾脏、肾组织中的总RNA,反转录为cDNA,进行5-LO和FLAP检测。

1.6.5 转基因小鼠蛋白水平表达检测:分别选取9、20、24号F0代转基因小鼠,提取总蛋白,采用W estern b lo t方法对腹腔细胞、骨髓细胞及脾脏、肾组织进行5-LO和FLAP表达检测。

1.7 统计学分析

采用SPSS 11.5统计软件包进行统计分析,所有实验结果以±s表示,均数比较采用t检验。

2 结果

2.1 转基因小鼠的制备

显微注射166枚受精卵,并将90枚注射过的受精卵移植于3只I CR受体小鼠的输卵管中,共产仔25只。

2.2 转基因小鼠的PCR检测结果

用所设计的特异引物对出生仔鼠进行PCR扩增检测,25只仔鼠中有7只小鼠能扩增出约900 bp大小的特异片段,其中5、8、9、11、14、15号泳道为阳性转基因小鼠,见图1。

2.3 转基因小鼠的Sou thern b lot检测结果

图1 部分F0代的转基因小鼠PCR检测电泳结果No te:M.DNA m arker DL2000;1.Control;2. Positive con tro l:pEGFP-5LO p lasm id;4.Negative contro l,nor m almouse;5-18:Transgenic founderm iceF ig.1 Electrophoretic resu ltsof PCR p roducts from transgenic m ice of founders

用Eco R I酶切PCR扩增阳性的F0代转基因小鼠和正常BDF1小鼠(阴性对照)基因组DNA,并以GFP-5LO基因PCR扩增产物作为探针,结果见图2, 1、9、13、17、20、22、24号PCR检测阳性小鼠基因组DNA可见特异整合条带,正常小鼠基因组DNA未见特异条带,证实PCR阳性小鼠基因组DNA中已稳定整合5-LO基因。

图2 转基因小鼠Southern b lot检测结果Note:The p robes:Positive contro l is PCR p roduct of hyg gene;Num ber 1,9,13,17,2,22,24 are positive transgenic m ice detected by PCR;N:Norm almouseF ig.2.Resultsof Southern b lo t of transgenic m ice

2.4 转基因小鼠的RNA水平检测结果

RT-PCR方法对9、20、24号5-LO转基因阳性小鼠的骨髓细胞、腹腔细胞、脾、肾组织内5-LO及FLAP进行检测,同时以正常BDF小鼠为阴性对照, β-actin为PCR体系内对照。实验结果见图3。

图3 转基因小鼠腹腔细胞、骨髓细胞、脾、肾的5-LO及FLAP mRNA检测结果F ig.3.Resultsof 5-LO and FLAP mRNA detected by RT-PCR of peritoneal cells,bone m arrow cells,sp leen and k idney of transgenic m ice

由图3可见转基因小鼠的骨髓细胞、腹腔细胞、脾、肾的5-LO和FLAP mRNA表达均高于正常小鼠,统计学分析表明5-LO转基因小鼠与阴性对照小鼠的骨髓、腹腔细胞的5-LO及FLAP比较均有显著差异,转基因小鼠间差异无显著性。

2.5 转基因小鼠的蛋白水平检测结果

W estern blot方法对9、20、24号5-LO转基因阳性小鼠的骨髓、腹腔细胞、脾、肾组织进行5-LO及 FLAP检测,同时以正常BDF1小鼠为阴性对照,βactin为体系内对照,实验结果见图4。由图可见转基因小鼠的骨髓细胞、腹腔细胞、脾、肾的5-LO和FLAP蛋白表达均明显高于正常小鼠,统计学分析表明5-LO转基因与阴性对照小鼠的骨髓、腹腔细胞、脾、肾的5-LO及FLAP比较均有极显著差异,而转基因小鼠间差异无显著性。

图4 转基因小鼠腹腔细胞、骨髓细胞、脾、肾的5-LO及FLAP蛋白检测结果F ig.4.Resultsof 5-LO and FLAP p roteins detected byW estern b lo tof peritoneal cells,bonem arrow cells,sp leen and kidney of transgenic m ice

3 讨论

人5-LO基因定位于10号染色体q11.2亚带,长度超过82 kb,包含14个外显子,被13个内含子分隔开,分子量约为80×103。5-LO是生物机体炎症反应过程的中枢酶,能够产生具有信号调节功能的脂类介质白三烯——机体炎症反应中重要的活性生物分子,控制着白三烯及前列腺素酶等因子的生物合成链,特定引导白三烯家族炎性因子的生物合成通路[5]。在外来受体信号的诱导下5-LO在静息的细胞内与FLAP相结合,进一步产生白三烯B4(LTB4)、白三烯C4(LTC4)、白三烯D4(LTD4)及白三烯E4(LTE4)等一系列炎性因子,5-LO主要在巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞、树突状细胞中表达,同时巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、平滑肌细胞及血管内皮细胞表达白三烯细胞膜受体,这样白三烯分子与其受体在这些细胞表面以自分泌和旁分泌的形式相互作用,导致AS炎症在血管内壁上的发生和发展。来自临床AS患病标本的实时RT-PCR检测证明5-LO存在于主动脉、颈动脉、冠状动脉的损伤的血管壁中,在AS发病的不同阶段中, IV-V期患者血管壁中的5-LO+细胞数目高于II-III期患者,显示5-LO+细胞数与AS病变程度正相关性,同时还检测到5-LO通路中FLAP、LTA 4、LTC4等相关蛋白的存在[8]。血管内皮细胞、巨噬细胞和血管平滑肌细胞是动脉粥样硬化形成过程中三种最主要的反应细胞,但是白三烯炎症因子及其受体是如何在三种反应细胞中相互作用最终导致AS发生的炎症反应机制目前尚不完全清楚。为此,我们拟通过显微注射的方法将外源5-LO基因导入小鼠基因组中建立5-LO过表达的转基因小鼠,以期在动物整体水平上观察研究5-LO蛋白过表达及其下游产物与AS发生发展的相互关系。

目前我们已经利用显微注射的方法获得7只阳性转基因小鼠,从Southern b lo t的检测结果可以看出转基因小鼠外源DNA已稳定整合到基因组中, 5-LO转基因小鼠与阴性对照小鼠的腹腔细胞、骨髓细胞的5-LO基因RT-PCR和W estern b lot检测结果比较差异均有显著(P<0.05),脾、肾组织的5-LO mRNA表达虽然高于正常小鼠,但是统计学分析差异无显著性,而脾、肾组织的5-LO蛋白表达高于正常小鼠且差异具有显著性(P<0.05),转基因小鼠间5-LO和FLAP表达检测差异无显著性,而且FLAP蛋白RT-PCR和W estern检测结果与5-LO实验结果相似,与正常阴性对照小鼠比较差异亦有显著性,也进一步证明外源5-LO基因已在转基因小鼠相应组织内表达。在图2中可以看到转基因小鼠Southern杂交带为多条,不同转基因小鼠间杂交带有一定的差异,提示外源基因可能串联重复序列整合入基因组或多位点整合,然而RT-PCR和W estern表达检测结果转基因小鼠间比较差异并无显著性,提示外源5-LO基因的拷贝数可能对转基因小鼠5-LO的表达之间可能没有直接的关系,有待于做进一步的实验研究。

本实验采用显微注射法制备转基因小鼠,外源目的基因以随机方式整合入小鼠基因组中,外源基因的整合位置或拷贝数可能影响转基因小鼠繁育传代,通过5-LO转基因小鼠繁殖传代及RNA和蛋白水平实验检测观察,部分转基因小鼠始终不孕,而9、20、24号转基因小鼠均有子代阳性小鼠,其中9号小鼠外源基因的表达最为稳定,现已传至F2代(结果待发表)。

综上所述,根据实验结果我们可以判定已经建立5-LO转基因小鼠,为下一步药物诱导5-LO转基因小鼠实验进行动脉粥样硬化实验研究打下了良好的基础。

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Con struction of a 5-L ipoxygenase Tran sgen ic M ice

ZHANGM ei-ying,WU Hong-lian,YANGW ei,L I Zhao-yang,DONGW an-wei,ZHOU Sheng-lai, YU Yang,WANGW ei,LüX iang-chuan,Q IN Ying,ZHENG Zhi-hong,WANGLu-zeng
(Laboratory Anim al Center,ChinaM edicalUniversity,Shenyang 110001,China)

O b jective To construct a 5-lipoxygenase(5-LO)transgenic mouse model of atherosclerosis.MethodsPurified 5-LO fragm ent w as in jected into m ale p ronucli and the firtilized eggs were transp lanted into pseudop regnantm ice.PCR and Southern blotwere used to detect the genotype ofDNA separated from the newborn mouse tail tissues.RT-PCR andW estern b lot analysiswere used to detect the gene transcrip tion and exp ression.ResultsPCR and Southern blot results showed that 7 of 25 m ice were transgenic m ice.Exp ression of 5-LO and FLAP w as found in the bone m arrow,sp leen,kidney,and peritoneal cells.Resultsof RT-PCR and W estern blot show ed that No.9,20,24 transgenic m ice exp ressed a higher level of 5-LO and FLAP than those in the w ild type C57BL/6 m ice.The exp ression levels in bone m arrow and peritoneal cellswere significantly different(P<0.05).ConlusionA 5-LO transgenic mouse line has been estab lished in this study and m ay be used for future study on the function of 5-LO gene.

5-lipoxygenase;A therosc lerosis;Transgenic m ice

R711.75

A

1005-4847(2010)01-0060-05

2009-07-14

辽宁省高校科研项目计划(2008S239);辽宁省科技厅攻关项目(2008408002-2);国家科技重大专项—药物安全评价技术平台建设(编号:2008ZX09305-004)。

张梅英(1965-),女,研究方向:实验动物转基因。E-m ail:zhm eiying@163.com