大鼠原位膀胱癌模型的建立与CT诊断价值

唐小莹,潘春武,孙俊,黄蔚,王华枫,沈周俊

(上海交通大学医学院附属瑞金医院,上海 200025)

研究报告

大鼠原位膀胱癌模型的建立与CT诊断价值

唐小莹,潘春武,孙俊,黄蔚,王华枫,沈周俊

(上海交通大学医学院附属瑞金医院,上海 200025)

目的 研究N-甲基亚硝基脲诱导大鼠原位膀胱癌模型的构建过程以及计算机断层扫描对大鼠原位膀胱癌的诊断价值。方法50只SD大鼠随机分为两组,对照组A组15只,实验组B组35只。B组大鼠经尿道膀胱内灌注MNU每两周一次,每次2 m g,共4次。A组大鼠用生理盐水以同样的方法灌注。于第14周末对两组大鼠进行膀胱CT扫描诊断,并且处死后取膀胱组织行病理学观察。结果B组28只大鼠CT扫描膀胱均见明显异常,表现为局部肿块突起或膀胱壁不规则增厚、密度不均,病理诊断均为膀胱癌。A组13只大鼠经CT扫描未发现膀胱肿瘤,病理检查未见肿瘤组织。结论MNU可以诱导大鼠原位膀胱癌模型的建立。CT扫描可作为大鼠原位膀胱癌诊断的可靠方法,并能为肿瘤的化疗或放疗等后续实验提供更好的大鼠模型。

MNU;原位膀胱癌;CT诊断

膀胱癌是我国泌尿系统中最高发的肿瘤,构建膀胱癌动物模型对于研究人类膀胱癌有着重要的意义。N-甲基亚硝基脲(N-m ethyl-nitrosourea,MNU)作为化学致癌剂用于建立原位膀胱癌动物模型虽然在国内外已有研究和报道[1],但是模型建立后通常是应用处死后的病理学诊断来判断模型是否成功建立,从而无法对建模后的动物进一步行体内实验研究。因此我们应用CT(computed tomography)这种无需处死动物的检查方法来对动物模型的建立及后续实验进行评判与指导。

1 材料与方法

1.1 仪器与主要试剂

MNU(规格为每瓶1g),美国Sigm a公司产品,用避光玻璃瓶分装为每瓶200 m g,置于-4℃冰箱封存。枸橼酸缓冲液的配置:枸橼酸4.2 g,氢氧化钠2.1 g,加去离子240 mL水振摇使之溶解,用5mol/L浓盐酸调节pH值至6.0,再加去离子水至250 mL,摇匀即可。

1.2 实验动物及分组

选用10周龄～12周龄SPF级雌性SD大鼠50只,体质量(200±10)g,由上海交通大学医学院动物科学部提供【SCXK(沪)2004-0001】,插管操作过程在屏障动物实验室进行【SYXK(沪)2008-0050】。实验大鼠用耳朵打孔标记法标记,随机分为两组,A组15只(对照组),B组35只(实验组)。饲养条件:SPF级动物实验室,常规饮食,12 h昼夜节律,湿度50%～60%,温度24～26℃。实验过程中按照实验动物3R原则对大鼠给予人道的关怀。

1.3 实验方法

1.3.1 MNU溶液的配置:实验前取一瓶分装的MNU,用临时配置的pH 6.0浓度为0.1 mmol/L的枸橼酸缓冲液10 mL将MNU溶解,此时MNU浓度为20 m g/mL,膀胱灌注每只大鼠用量为0.1 mL。

1.3.2 MNU膀胱灌注:2%戊巴比妥腹腔麻醉(50 mg/ kg)生效后仰卧固定,0.1%新洁尔灭溶液消毒外阴部,用长约6 cm的自制导尿管从尿道外口插入膀胱,抽出尿液后,A组每只注射生理盐水0.1 mL,B组每只注入MNU溶液0.1 mL。每两周灌注一次,共4次。

1.4 CT扫描

CT扫描用美国GE公司light speed 16层螺旋CT机,扫描层厚1.25 mm。于实验第14周末,麻醉大鼠后置入导尿管用生理盐水充盈膀胱,随后进行腹部CT扫描,观察扫描图像。A、B两组所有大鼠都进行腹部CT扫描。

1.5 标本制备

于第14周末CT扫描后处死所有大鼠,观察膀胱、肾脏等有无病变,取出新鲜的膀胱组织浸于10%甲醛中固定24 h,常规石蜡包埋,切片4～5 μm,HE染色。

1.6 统计学处理

通过平行组对照设计分析,比较两组样本诱癌率,采用χ2检验,P<0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般观察

大鼠一般于麻醉后2h左右开始苏醒,4h能够恢复活动。实验过程中A组大鼠死亡2只,B组大鼠死亡7只,其中B组有三只大鼠在第14周初死亡。整个实验中大鼠死亡9只,尸解发现其中因肿瘤晚期恶液质死亡的有3只,因麻醉后压迫窒息死亡的有3只、因尿路严重化脓性感染致死的有2只、因麻醉针刺入肠腔致弥漫性腹膜炎致死的有1只。B组中于第14周初死亡的三只大鼠体重明显减轻,其余大鼠体重增长率与A组接近,活动正常。第14周时B组有8只大鼠出现肉眼血尿。

2.2 病理学肉眼观察

A组13只大鼠膀胱黏膜光滑,壁薄,厚度均匀,血管纹理清晰,未见肿块新生物等,其中一只大鼠出现膀胱内结石,直径约4 mm。B组31只大鼠(包括第14周初死亡的3只大鼠)膀胱黏膜均出现异常,出现菜花样肿块或米粒样新生物的有15只,局部黏膜不规则增厚的14只,黏膜出现细颗粒的2只,其中有3只大鼠出现了膀胱或(和)输尿管结石(9.7%),7只大鼠出现肾盂或(和)输尿管积水(22.6%)。

2.3 病理组织学切片观察

光镜结果:A组所有大鼠膀胱黏膜均为3～4层移行上皮细胞组成,细胞呈扁平状,大小均一,排列有序,核圆,规则,黏膜细胞核质比1∶4～6,由内向外依次为黏膜层、固有层、肌层和浆肌层(图1A、B)。B组大鼠膀胱黏膜总体表现为黏膜细胞大小不一,移行上皮细胞层数明显增多,排列紊乱,极向消失,核大不规则,核染色质为颗粒状,分布不均匀,核膜增厚,核仁肥大,核质比例增大,核分裂像明显(图1C、D)。A组8只大鼠和B组17只大鼠膀胱黏膜有中度慢性炎症。图1见彩插2。

2.4 CT扫描观察结果

A组大鼠膀胱充盈显示良好,膀胱壁薄,光滑,厚度均一,组织界限显示清晰(图2A);B组扫描的28只大鼠膀胱均有不同程度影响学异常,表现为突起的米粒样肿块(图2B)、隆起的菜花样肿块(图2C)、局部膀胱壁黏膜增厚(图2D)等。CT扫描对膀胱癌的诊断与其病理诊断完全相符。图2见彩插2。

2.5 诱发大鼠原位膀胱癌模型结果

第14周末:A组大鼠致癌率0/13(0%),死亡率2/15(13.3%);B组实验组大鼠致癌率31/31 (100%),死亡率7/35(20%)。B组大鼠致癌率与A组比较有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

在膀胱肿瘤动物模型建立方面研究者已经找到多种实验方法,化学致癌剂诱癌法在建立膀胱原位癌模型方面有着诸多的优点[2]:①有较强的膀胱选择性;②诱癌周期相对短;③诱癌率高,可达100%;④诱发的肿瘤与人类膀胱癌的组织学相似;⑤对实验动物要求低,一般实验动物均可诱癌。MNU作为一种较多使用的诱导大鼠原位膀胱癌模型的化学致癌剂,国内已有学者对其研究及应用,其诱癌方法简单,致癌率高,致癌效果明显[3]。MNU诱导的膀胱癌其形态学与病理学特征和人膀胱癌相似,肿瘤源于黏膜上皮,为移行上皮癌,本实验病理结果与刘红耀等[4]报道基本相符。实验中未出现肿瘤转移,与杨玉成等研究的结果相同[5]。因此经尿道膀胱灌注MNU法诱导大鼠原位膀胱癌模型方法可行可靠,效果确切。

本实验中A组大鼠死亡2只(2/15),B组大鼠死亡7只(7/35),两组大鼠死亡率无统计学差异(P >0.05),故经尿道膀胱灌MNU诱导大鼠原位膀胱癌的方法不会引起大鼠死亡率的明显增加。但是分析这9只大鼠的死亡原因构成会发现,因操作和管理不当以及感染所致大鼠死亡的占66.7%(6/9)。麻醉后的大鼠聚集在一起容易发生窒息,特别是前后麻醉时间间隔相差大的大鼠放在同一笼时更易发生,反复进行侵袭性操作也易出现感染,因此加强对实验大鼠麻醉后的管理与预防感染能够降低实验大鼠的意外死亡率,从而提高研究工作质量和降低实验建模的成本。

大鼠膀胱癌模型建立后,处死大鼠对其膀胱进行病理学检查是诊断膀胱癌的金标准。但是建立大鼠膀胱癌模型后通常需要继续进行体内实验,因此只能用非处死方法鉴定模型是否成功建立:可以通过解剖观察后再缝合的方法确认致癌效果,但是容易出现感染、肿瘤种植致死等缺点;也可以用AO染色法检测24h尿脱落细胞,但是阳性率低,假阳性率高;用生物发光法检测肿瘤模型[6],虽然诊断率较高,但是不能直观地了解肿瘤的大小和形状;甚至MR I也可以检测大鼠膀胱肿瘤,但是费用比较高。然而用CT扫描的方法来鉴定动物肿瘤模型在国内尚不多见。本实验通过CT扫描来鉴定大鼠原位膀胱癌模型,其速度快,定位准确,显示直观清楚,大小可测量,平扫无创伤,诊断结果与病理诊断完全相符,诊断率达100%。尽管临床上CT难以发现早期局限于膀胱壁内的小于10 mm的肿块[7],但是因扫描层厚及对象不同,本实验中通过与病理结果对照发现CT扫描能够清楚显示出膀胱壁上直径大于2 mm的颗粒样肿块。因此,通过CT扫描诊断大鼠原位膀胱癌的方法相比而言更加灵敏、准确、直接、方便。

反复经尿道插管膀胱灌注易使大鼠出现尿道、膀胱或输尿管结石,甚至出现重度输尿管肾盂积水,这是经尿道灌注MNU诱导膀胱癌的缺点[8],但是本实验中可以通过CT检查将其筛选,从而可以剔除那些巨大结石或结石梗阻引起的肾盂输尿管积水等不利于进一步研究的肿瘤模型。另外在膀胱癌动物模型的治疗前后可以观察CT图像中肿瘤的范围、大小等变化来评价治疗效果。因此在动物肿瘤模型建立与治疗的实验中可以通过CT扫描的方法来获取相关的资料与数据,并能为进一步动物模型的实验研究提供便利。

(本文图1、2见彩插2。)

[1] Yam an O,Ozdiler E,Sozen S,et al.Trans m u rally absorbed intravesical chemotherapy w ith dimethylsulfoxide in an animal model[J].Int J U ro l,1999,6:87-92.

[2] Chen T,Na Y,W anibuchi H,et al.Loss of heterozygosity in (Lew is F344)F1 rat u rinary b ladder tumors induced w ith N-buty l-N-(4-hyd roxybuty1)nitrosam ine fo llow ed by dimethylarsinic acid or sodium L-ascorbate[J].Jpn J Cancer Res,1999,90(8):818-823.

[3] 丁鸿,钱立新.大鼠膀胱癌模型建立的实验研究[J].实验动物与比较医学,2007,27(1):32-36.

[4] 刘红耀,李晓东,米振国,等.N2甲基亚硝基脲的制备及其诱发膀胱肿瘤的作用[J].中华实验外科杂志,2000,17:548-549.

[5] 杨玉成,侯建全,周守军,等.MNU诱导的大白鼠膀胱肿瘤模型的建立及病理学动态观察[J].苏州大学学报(医学版),2006,26(1):41-43.

[6] Hadaschik BA,B lack PC,Sea JC,et al.A validated mouse model for orthotop ic b ladder cancer using transu rethral tumo r inocu lation and biolum inescence imaging[J].BJU Int,2007, 100:1377-1384.

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[8] 颜汝平,王剑松,徐鸿毅.膀胱癌的动物实验模型[J].国外医学泌尿系统分册,2005,25(4):446-448.

Estab lishm en t and CT D iagnosis of O r thotop ic Ra tM odel of B ladder Cancer

TANG X iao-ying,PAN Chun-wu,SUN Jun,HUANGW ei,WANG Hua-feng,SHEN Zhou-jun
(Rui Jin Hosp ital,Shanghai Jiao TongUniversity Schoo l ofM edicine,Shanghai 200025,China) Corresponding author:SHEN Zhou-jun

O b jective To establish an orthotop ic rat model of bladder cancer induced by N-m ethyl-nitrosourea (MNU)and to evaluate the diagnostic value of CT(computed tomography)scanning in this exper im entalmodel.M ethods 50 SD ratswere random ly divided into the control group(group A)w ith 15 rats and experim ental group(group B)w ith 35 rats.Each rat of group B was treated w ith 2 m g MNU per dose every other week,totally 4 doses,by per urethra adm inistration.M eanw hile,each rat of group A was treated w ith norm al saline.Then,at the 14thweek,all the rats were evaluated by CT scanning and patho logical exam ination.ResultsAbnor m al changeswere detected in each of the 28 rats in group B by CT scanning,and m anifested as local m ass,thickening b ladder w all accompanied w ith heterogeneous density. B ladder cancer was d iagnosed by patho logy.However,no b ladder tumo r was detected by CT scanning and patho logical exam ination in group A.Conc lusion A rat model of orthotop ic bladder cancer can be estab lished by per urethra adm inistration ofMNU.CT scanning is a reliab le diagnostic technique concerning thismodel.Further mo re,this technique can render us a more suitab le rat model fo r further experim ental studies on chemotherapy and radiotherapy of b ladder cancer.

N-m ethyl-nitrosourea(MNU);O rthotop ic b ladder cancer;CT diagnosis;Rat

R737.14

A

1005-4847(2010)01-0006-03

2009-05-25

国家自然科学基金资助项目(编号:30571862)。

唐小莹(1980-),男,住院医师,硕士研究生,研究方向:膀胱癌与动物模型。

沈周俊,教授,博士生导师,E-mail:shenzj6@sina.com。