纯氧或空气环境复苏对新生大鼠缺氧性大脑皮质神经元超微结构的影响

高雪松,王自能

(暨南大学附属第一医院妇产科,广州 510632)

研究报告

纯氧或空气环境复苏对新生大鼠缺氧性大脑皮质神经元超微结构的影响

高雪松,王自能

(暨南大学附属第一医院妇产科,广州 510632)

目的 应用缺氧动物模型比较纯氧环境(pure oxygen environm ent,POE,100%氧)与空气环境(room air environm ent,RAE,21%氧)复苏对新生大鼠缺氧性大脑皮质神经元超微结构的影响。方法7日龄20只SD (Sp rague Daw ley)乳鼠建立缺氧2.5 h模型后,分为纯氧环境组(POE)和空气环境组(RAE),每组再根据复氧后时间点分为2个亚组,即24 h组和72 h组,每亚组5只。按时间点取各组乳鼠大脑半球右侧额顶皮质行电镜样品制备,透射电镜观察。结果复氧各组均可见神经元、神经毡和细胞间隙水肿。RAE 24 h组神经元核膜结构不清,细胞器减少,线粒体肿胀、空泡化、嵴断裂;粗面内质网扩张,常呈空泡状,核糖体减少;高尔基复合体囊泡扩张;溶酶体较多。RAE 72 h组细胞器改变同前,但类似凋亡的细胞核较多,坏死细胞亦较其他组多见。POE 24 h组病变较RAE 24 h组轻。POE 72 h组细胞内线粒体及粗面内质网较丰富,病变亦比RAE 72 h组轻。结论POE复苏较RAE复苏可更能缓解缺氧致神经元超微结构的损伤、减少细胞凋亡及减轻脑水肿。提示,纯氧环境对缺氧复苏后大脑皮质神经元有一定的保护作用,并表明本动物模型适合缺氧新生大鼠大脑皮质神经元研究。

复氧;超微结构;神经元;大脑皮质;缺氧新生大鼠

新生儿窒息是严重的围产医学问题之一,它致使每年有近一百万患儿死亡和同样数目的严重后遗症。近来随着医疗技术的改进,高危儿存活率明显提高,存活新生儿中枢神经系统的发病率也相应增加,早期干预可使高危儿中枢神经系统发育障碍的状况得到改善。对低氧致缺氧性脑损伤,复氧后脑超微结构的研究报道甚少。本研究是在建立新生大鼠缺氧动物模型基础上,分别采用纯氧环境与空气环境复苏,应用透射电镜观察,比较纯氧与空气对缺氧性大脑皮质神经细胞超微结构的影响,为临床进行新生儿窒息复氧方案及新生大鼠缺氧动物模型的建立提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组与模型制备

1.1.1 分组:取清洁级7日龄SD(Sp rague Daw ley)乳鼠20只,由南方医科大学实验动物中心提供【SCXK(粤)2006-0015】,体质量(12.3±1.18)g,雌雄不拘,在制成缺氧模型后,随机分为纯氧环境组(pure oxygen environm ent,POE,100%氧)(n=10)与空气环境组(room air environm en t,RAE,21%氧) (n=10),每组再根据复氧后时间点分为2个亚组,即24 h组和72 h组,每亚组5只。

1.1.2 动物模型制作:参照经典Rice等[1]缺血缺氧动物模型制作及吕国蔚等[2]小鼠急性缺氧动物模型制作,本研究对乳鼠未行颈总动脉结扎手术操作,仅进行缺氧模型制作,首先制做透明有机玻璃密封低氧小舱,小舱体积为2 L,舱内底层置钠石灰,以吸收二氧化碳和湿气,两侧舱壁上下各有1个直径2cm的小孔,分别接低氧气瓶和排气管道,排气管道通入水瓶中,以保持容器内压力与大气一致及持续低氧状态。实验时,将低氧小舱置于37～38℃水中水浴,使舱内温度控制在36℃左右,将20只乳鼠置于预热的低氧小舱内,输入体积分数为8%氧和92%氮的混合气体(广州气体厂提供),流速为1.5 L/m in,至2.5 h时乳鼠出现明显发绀、喘呼吸、痉挛样动作和翻正反射难以完成,达到急性缺氧表现要求[2]。在制成缺氧模型后,立即将乳鼠分为POE组和RAE组。将POE组置于纯氧舱,通入100%氧,流速为5 L/m in,舱内温度控制在36°C左右;RAE置于同一室内空气舱中,各30 m in。实验结束后,放回原母鼠笼中饲养。

1.2 取材、电镜标本制作与观察

复氧后按时间点,将乳鼠断头处死,开颅,迅速在脑表面滴加预冷生理盐水,在冰浴下取脑,快速切取丘脑段冠状断面(约厚3 mm)组织块,于灰结节右侧缘,按照与矢状沟平行的方向,切取大脑半球右侧额顶皮质矢状断面,将标本修成约1 mm3的细小组织3块,2.5%戊二醛固定,Epon812包埋,半薄切片,甲苯胺蓝染色,光镜下定位,再修块,取皮质第五层,作超薄切片,醋酸双氧铀与硝酸铅双重染色。在JEOL 100CX II/T型透射电镜下观察,重点观察各组神经元的超微结构变化。

2 结果

复氧各组均可见神经细胞、神经毡及间隙水肿。部分神经细胞呈现不同程度的退行性病变;见少量坏死细胞和类似凋亡的细胞核,后者核固缩,核形状不规则,染色质边聚,核膜完整,有的形成内褶,有的突出,且含染色质,似有凋亡小体形成趋势。

2.1 空气环境组

2.1.1 空气环境24 h组:可见生物膜受损,核(nuc lei,N)膜结构不清晰;细胞器减少,线粒体(m itochondria,M it)损伤明显,肿胀,空泡化,膜局部模糊或缺失、嵴断裂或缺失、有的甚至髓样变;粗面内质网(rough endop las m ic reticulum,RER)扩张常呈空泡状(图1),核糖体减少;高尔基复合体囊泡扩张;溶酶体增多,含残余体。

2.1.2 空气环境72 h组:细胞器改变同上,从图2可见神经元细胞核呈现出类似凋亡的改变,核形态不规则,形成内褶,染色质边聚。空气环境72 h组类似凋亡的细胞核较其他组多见。坏死细胞也较POE 72 h组多见。该组细胞周间隙仍增宽,电子密度亦低。

注:N:核;M it:线粒体;RER:粗面内质网。图1 空气环境24 h组Note:N:nucleus;M it:m itochond ria;RER:rough endop las m ic reticulum.F ig.1 The u ltrastructure of a neuron in a rat of the RAE 24 h group.

图2 空气环境72 h组F ig.2 The u ltrastructure of a neuron in a rat of the RAE 72 h group.

2.2 纯氧环境组

2.2.1 纯氧环境24h组:与空气环境24 h组比含较多的线粒体,亦可见有的神经元线粒体肿胀,嵴断裂或消失,或髓样变;粗面内质网扩张,核糖体减少。但病变较空气环境24 h组轻。见图3。

2.2.2 纯氧环境72 h组:从图4可见该组细胞内线粒体及粗面内质网较空气环境组丰富。有的神经元也见线粒体肿胀、变性,还可见较长而大的线粒体;有的粗面内质网可见轻度扩张和核糖体减少;有的仍可见高尔基复合体囊泡扩张和溶酶体。但病变比空气环境组轻。

3 讨论

注:N:核;M it:线粒体;RER:粗面内质网。图3 纯氧环境24 h组Note:N:nucleus,M it:m itochondria;RER:rough endop la sm ic reticu lum.F ig.3 The u ltrastructure of a neuron in a rat of the POE 24 h group.

注:N:核;M it:线粒体;RER:粗面内质网。图4 纯氧环境72 h组Note:N:nucleus,M it:m itochond ria;RER:rough endop la sm ic reticu lum.F ig.4 The u ltrastructure of a neuron in a rat of the POE 72 h group.

本研究选用清洁级7日龄大鼠,除保证动物健康及动物来源方便外,其脑组织结构及血液供应与人相似,更重要的是其大脑组织学发育程度与足月新生儿的大脑发育程度相似。新生儿期脑的代谢最旺盛,脑的耗氧量约占全身的一半,因此,脑缺氧时容易受损。近年来,许多学者观察到缺氧是新生儿缺氧缺血性脑病的重要原因。蒋犁等[3]在新生大鼠脑细胞凋亡与缺氧、缺血两因素析因研究中发现,大脑皮质缺氧比缺血效应大。有学者在体内、外实验中,观察到去核细胞(denuc leated cells)可诱导进行性程序性细胞死亡(凋亡);在大多数核改变前呈现细胞器高度有序的异常,例如粗面内质网肿胀、高尔基复合体水肿及线粒体破坏。提出存在不依赖于细胞核的细胞质凋亡通路[4],支持本研究结果。本实验采用缺氧动物模型,在复氧后观察到各组神经元、神经毡及间隙水肿;部分神经元呈现不同程度的退行性变,以细胞器改变最明显。

3.1 复氧后线粒体改变的意义

近年来的研究发现线粒体功能障碍在缺氧缺血后神经元损伤中起关键作用。缺氧时有多种促凋亡级联转导信号整合于线粒体通透性转变孔道(m itochond ria per m eability transition pore,M PTP), M PTP开放,线粒体跨膜电位降低,内膜通透性突然增加,Ca2+内流增加,膜间隙内存储的大量促凋亡分子。例如细胞色素C、凋亡诱导因子和各种半胱天冬酶原等,被释放到胞质中,引起凋亡级联反应, DNA裂解为60 kb左右的片段,染色质异常凝集和DNA的大规模断片化,而致神经细胞急性坏死或凋亡[5]。本研究发现新生大鼠脑缺氧复氧后,空气环境组神经元的线粒体变性显著,线粒体功能损伤较严重,致使空气环境72 h组细胞凋亡及细胞坏死最为明显,提示,纯氧环境复苏可能通过改善线粒体呼吸功能,促使线粒体内膜通透性趋于稳定,缓解继发性能量衰竭,使其病变有所减轻。

3.2 复氧后内质网和高尔基复合体改变的意义

粗面内质网是一个高水平的调控系统,是蛋白质合成、修饰及折叠的重要场所,也是调节细胞应激反应的场所。Q i等[6]在小鼠缺氧30 m in后大脑皮质中观察到缺氧造成严重内质网损害及ER应激引发caspase-12的增高。有报道,在缺氧缺血刺激下,大量未折叠蛋白可在内质网中堆积,导致内质网应激(endop las m ic reticu lum stress,ERS)。近来研究发现过度ERS也是一条细胞凋亡信号传导通路。发生过度ERS启动的细胞凋亡信号传导通路,引起ER内Ca2+释放,导致胞质内Ca2+稳态失衡,活化位于ER胞质面的常驻分子caspase-12,激活caspase-3而诱导凋亡[7]。另外氧自由基还可引起P53的积累,进而促进内质网释放TNF-α和Fas,也能与DNA复制蛋白A结合,阻止DNA复制,上述效应最终激活caspase-3、6、7,促进细胞凋亡[8]。Nakagawa等[9]观察到高尔基复合体含有促凋亡分子神经节苷脂GD 3结合位点,利于caspase-12活化,介导特异性凋亡通路。本研究纯氧环境72 h组粗面内质网和高尔基复合体病变比空气环境72 h组轻,提示,纯氧环境可随时间进程,减轻ER应激性反应和随后的凋亡信号转导通路,促进适应反应;促使氧应激反应的衰退等,对缺氧造成的伤害起到一定程度的缓解作用。

有报道指出在缺氧和酸中毒时,溶酶体稳定性降低,可导致溶酶体膜破裂,溶酶体酶释放,释放出的酸性水解酶,能直接破坏细胞本身的成分,引起细胞内消化、自溶而坏死[10]。本研究观察到空气环境组比纯氧环境组溶酶体增多,可能是由于空气环境组细胞器病理改变较重,激活溶酶体功能,导致自身消化能力增强。

以上不难看出,本研究纯氧环境复苏72 h对缺氧引起的新生大鼠大脑皮质神经细胞损害改善效应大于空气环境复苏,提示,纯氧环境较空气环境可更能缓解缺氧致神经细胞超微结构的损伤、减少细胞凋亡及减轻脑水肿,纯氧环境对缺氧复苏后大脑皮质神经元有一定的保护作用,为临床选择使用纯氧环境或空气环境复苏及新生大鼠缺氧动物模型的建立提供了科学依据。

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Effects of Resusc ita tion a t 100%O xygen Env ironm en t or Room A ir Env ironm en t on the U ltrastructure of Neuron s in the Cerebra l Cor tex of Hypox ic Neona ta l Ra t

GAO Xue-Song,WANG Zi-neng
(Departm ent ofObstetrics&Gyneco logy,The FirstA ffiliated Hosp ital of Jinan University,Guangzhou 510630,China)

O b jective To compare the effects of resuscitation at pure oxygen environm ent(100%oxygen)or room air environm ent(21%oxygen)on the u ltrastructure of cerebral cortical neurons in hypoxic neonatal rat.M ethods Twenty Sp rague-Daw ley neonatal rats aged 7 days were divided into the pure oxygen environm ent(POE)and room air environm ent groups(RAE)after hypoxia,and each group was divided again into 24 h and 72 h subgroups.The pupswere p laced in an incubato r containing 8%O2to be at acute hypoxia continued for 2.5 h.The pups were reoxygenated imm ed iately after the above m entioned hypoxia.The pup s of POE group were then p laced in an incubato r containing 100% oxygen and the flow tim e was 30 m in.The pups of RAE group were reoxygenated w ith room air in an incubator for 30 m in. A cco rding to the p lanned t im e points the pup swere sacrificed and the b rain was removed at 24 h and 72 h after trea tm en t, respectively.The tissue of fron toparietal co rtex of the righ t cereb ral hem isphere was p repared fo r transm ission electron m icroscop ic exam ination.ResultsIn each reoxygenation group,edem a was found in the neurons,neurop il and in tercellu lar space.In the RAE 24 h group,the nuc learm em b rane in neu rons was unc lear,the amoun t of cell o rganelles was reduced,the m itochond ria were s wo llen w ith dam ages of cristae.The rough endop lasm ic reticulum was dilatated or vacuo lized and w ith reduction of ribosom es.The Go lgi com p lex was vacuo lized.The num ber of lysosom es was obviously increased.In the RAE 72 h group s,the changes were s im ilar to those of the fo rm er group,bu t apop to tic-like nuc lei andnecro tic neuronswere mo re frequen tly seen.The cellu lar dam ages of POE 24 h group were m ilder than those of RAE 24 h group.The m itochond ria and rough endop lasm ic reticu lum were more abundant and showed less patho logical changes in the POE 72 h group as compared w ith those of RAE 72 h group.Conc lusion The rats of POE reoxygenation disp lay m ilder ultrastructural dam ages,less apop tosis,necrosis and edem a in cerebral neurons than those in rats after RAE reoxygenation. The p rotective effect of POE resuscitation on cerebral dam age of hypoxic neonate rats is superior to that after RAE resuscitation.This hypoxic neonatal ratmodelm ay serve as a suitab le anim almodel for research on cerebral cortex neurons caused by hypoxia.

Reoxygenation;U ltrastructure;Neuron,cerebral cortex;Hypoxia;Neonatal rat

R714

A

1005-4847(2010)01-0074-04

2009-03-11

高雪松(1972-),女,硕士,暨南大学附属第一医院妇产科主治医师,研究方向:围产医学神经生物学。E-m ail:tgxs@jnu. edu.cn