西藏小型猪细胞色素b基因序列的比较

李洪涛,肖东,顾为望,吴清洪,袁进,王万山,张嘉宁

(1.广州医学院第一附属医院,广州 510120;2.南方医科大学实验动物中心,广州 510515)

研究报告

西藏小型猪细胞色素b基因序列的比较

李洪涛1,肖东2,顾为望2,吴清洪2,袁进2,王万山2,张嘉宁2

(1.广州医学院第一附属医院,广州 510120;2.南方医科大学实验动物中心,广州 510515)

目的 对西藏小型猪Cyt b-基因序列进行分析,研究其遗传背景及其与国内家猪的亲缘关系。方法提取西藏小型猪和巴马小型猪、贵州香猪、五指山猪的全基因组DNA,设计引物扩增Cyt b基因,测序后进行碱基序列比对,建立亲缘关系树,分析西藏小型猪的遗传背景。结果西藏小型猪等国内部分品种猪的Cyt b基因序列与欧洲猪相比有14个变异位点;但是西藏小型猪与国内品种猪相比存在两个特殊碱基位点即在420位点T→C转换的同时在883位点存在G→A转换。结论西藏小型猪与巴马小型猪、贵州香猪、五指山猪等国内家猪有很近的亲缘关系。同时进一步证实西藏小型猪群体内存在一定的遗传分化。

西藏小型猪;细胞色素B基因;比较研究

细胞色素b(Cyt b)基因是m tDNA中重要的蛋白编码基因,编码细胞色素的一个亚基,它包含种间乃至到科间的进化遗传信息,广泛用来进行法医学种属鉴定[1,2]和脊椎动物种上和种下分类阶元的系统进化研究,被认为是解决系统发育问题最可信的m tDNA标记之一[3]。国内学者对我国的黄牛品种[4]、绵羊[5]、山羊[6]的Cyt b基因遗传多态性和系统发育关系进行了分析,对动物起源的研究有了更为科学的推断。

猪的Cyt b基因碱基序列与人类以及牛、羊等哺乳动物一样全长为1140 bp,同样存在着广泛的多态性,并按母系遗传方式传递给下一代。在对西藏小型猪m tDNA控制区的研究中,根据m tDNA控制区串联重复区的长度和重复片段存在异质性,将西藏小型猪体分为A型和B型[7]。母系系谱分析显示,串联重复区的排列类型同样由母本传给后代,与父本没有关系。2004年南方医科大学从西藏自治区工布江达县将50头藏猪(雌、雄各半)引种到广州,首次开展对藏猪进行实验动物化的培育,并将其命名为西藏小型猪(Tibet m ini-p ig),2006底获得广东省实验用西藏小型猪生产质量合格证。本项研究的目的就是在对线粒体控制区研究的基础上,分析西藏小型猪Cyt b基因的碱基序列,研究西藏小型猪Cyt b基因序列与线粒体控制区序列的变异是否存在相关性,以及西藏小型猪的遗传分化以及与其他小型猪的亲缘关系,对小型猪新品系的培育具有重要的理论指导意义。

1 材料和方法

1.1 实验材料

由南方医科大学实验动物中心提供西藏小型猪DNA样品23份(代表m tDNA D-loop5′端序列的主要单倍型个体),巴马小型猪、贵州香猪和五指山猪的DNA样品[7]。另外从GenBank下载的13种国内外的代表猪的m tDNA Cytb基因碱基序列用于比对研究。具体品种和GenBank登录号为:欧洲猪(AJ002189)、杜洛克(Duroc-AY830186)、JNP1-AY830173、S WB1-AY237510、 IB1-AY237484、汉普夏(Hampshire–AY 830187)、PAuk01 New Zealand-DQ444707、瑞典野猪(Swedish w ild boar-AF304 203)、Landerace-AF486866、大白猪(LW 2-AF136548)、荣昌猪(Rongchang–AF486860)、香猪(X iang-AF486859)及梅山猪(M eishan-AF304200)。

1.2 Cyt b基因序列扩增和分析

参照文献[8]设计特异引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物:Cyt b gene 14109到15355(forw ard:5′-CACGACCAATGACATGAAAAATC-3′,and reverse:5′-TGGCCC-TCCTT TTCTGGTTTA-3′)。产物扩增采用一管便捷式PCR试剂盒:2×Pfu PCR M aste rM ix进行目的产物的扩增。

反应体系50μL,包括DNA模板2μg、P1和P2分别为(10μmol/L)2μL、2×Pfu M aste rM ix 25 μL、ddH2O 19μL。扩增程序:预变性94℃5 m in; 94℃45 s,55℃45 s和72℃1 m in,35循环;72℃延伸7 m in后4℃保存。产物进行电泳观察。扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,结合C lustalw软件和M EGA 3.0软件进行所测序列比对,并经人工核查,确定变异位点,建立西藏小型猪和国内其他猪的亲缘关系树。

2 结果

2.1 西藏小型猪Cyt b碱基全序列比对

西藏小型猪和其他三种小型猪Cyt b基因序列扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果,见图1。以扩增用引物作为测序引物,测定2个反应结果,拼接后得到扩增片段的全序列大约1247 bp,去掉两翼的107 bp序列后得到完整的1140 bp Cytb基因序列。西藏小型猪Cyt b序列和其他猪一样全长为1140 bp,西藏小型猪Cyt b基因的碱基组成G+C含量为42%,A+T含量为58%;有9个变异位点,核苷酸多样性为0.078 9。A型和B型西藏小型猪的碱基组成差异无统计学意义。

图1 西藏小型猪、巴马小型猪、五指山猪和贵州香猪Cyt b基因琼脂糖凝胶电泳图F ig.1 Agarose gel m app ing of Cyt b gene in the m ini-p igs.

2.2 西藏小型猪和国内家猪与欧洲猪Cyt b碱基序列比对

多序列比对分析显示,西藏小型猪与国内家猪的序列变异位点少,与荣昌猪相比,西藏小型猪的Cyt b碱基序列有6种单倍型(T M 01、04、17、28、43、45);巴马小型猪有3种单倍型(b14、15、16);贵州香猪有1种单倍型(g14);五指山猪有2种单倍型(w zs01、11)。这4种小型猪之间都有共享单倍型。欧洲猪Cyt b碱基序列比较,9个欧洲品种猪有5个变异位点,而国内家猪与欧洲猪的差异较大,见表1。

表1 西藏小型猪和其他猪Cyt b基因序列比对Tab.1 Variab le nucleotide sites of Cyt b gene of the four breeds of the m ini-p igs

西藏小型猪有14个位点与国内家猪相同而与欧洲猪不同,而且全部为转换位点,未见颠换或缺失、插入现象。另外与国内家猪相比,在420位点存在T→C转换,同时在883位点存在G→A转换,见表1。以欧洲猪作外围以Cyt b序列建立的亲缘关系树显示,国内家猪与欧洲猪完全分开,如图2所示,西藏小型猪也被分为两个部分。

3 讨论

T M、T MP:西藏小型猪;b:巴马小型猪;g:贵州香猪;wzs:五指山猪。欧洲猪(A 002189J)作为外围。图2 西藏小型猪和国内家猪与欧洲猪的亲缘关系树Note:T M,T M P:Tibet m ini-p ig;b:Bam a m iniature p ig;g: Guizhou xiang p ig;W uzhishan p ig.European p ig(AJ002189)as outgroup.F ig.2 The phylogenetic tree of the Tibetm ini-p igs, other Chinese p igs and European p igs.

通过对西藏小型猪m tDNA控制区序列研究,根据串联重复区10bp的重复片段及其排列,我们将重复片段完全一样的个体为A型,其余部分的个体为B型。同时,控制区(D-loop区)5′端有20个变异位点,包括转换和颠换,其中以三个转换位点较突出,即305位点t→c转换、500位点a→g转换、691位点a→g转换。A型和B型的变异,与5′端三个主要变异位点几乎是相对应的[7]。本实验主要以代表控制区5′端序列单倍型的西藏小型猪个体以及巴马小型猪、贵州香猪和五指山猪的部分单倍型个体的基因组DNA,扩增Cyt b基因序列与基因库中公布的部分国内家猪和欧洲猪序列比对发现,国内猪的Cyt b基因序列间的同源性较高;与欧洲猪的差异较大,至少有14个位点完全不同(转换位点)。从血缘关系树也可以看出国内家猪与欧洲猪的血缘关系较远,此一结果与许多文献结果一致[9-15]。在所测的23个西藏小型猪的序列当中,有两个特殊位点即在420位点T→C转换(11/23)的同时,在883位点存在G→A转换(12/23),这也是在亲缘关系树中相对分为两部分的主要因素。说明西藏小型猪的Cyt b基因序列也存在分化,由此说明线粒体控制区的分化,包括串联重复区的排列变化、5′端碱基序列的位点转换可能与Cyt b的分化存在很大相关性。这些分化变异是否对动物的生理生化指标产生影响还需要进一步比较研究。

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Com par ison of the Cy t b Gene Sequences in T ibetM in i-Pig and O ther Ch inese Pigs

L IHong-tao1,X IAO Dong2,GU W ei-wang2＊,WU Q ing-hong2, YUAN Jin2,WANGW an-shan2,ZHANG Jia-ning2
(1.FirstA ffiliated Hosp ital of GuangzhouM edicalUniversity,Guangzhou 510120,China;
2.Laboratory Anim al Center,SouthernM edicalUniversity,Guangzhou 510515,China)

O b jective To analyze the Cyt b gene sequences in Tibet m ini-p igs and clarify the differences and genetic relationship w ith other Chinese p igs.M ethod The sequence of Cyt b gene w as amp lified from genome DNA of Tibetm ini-p ig,Bam a m iniature p igs,Guizhou xiang p igs and W uzhishan(W ZS)p igs.A fter sequencing,the base sequences were compared and analysed.The b lood relationship tree and evo lution position of Tibet m ini-p ig were established.Resu lt There were 14 m utation sites between dom estic p igs in China and p igs from Europe.Besides there was a significant difference in two nuc leo tide site:a T→C sw itch in site 420 and the G→A s w itch in site 883 at the sam e tim e.Conc lusion Chinese p igs include Bam a m iniature p igs,Guizhou xiang p igs andW ZS p igs,have a very close b lood relationship w ith som e of Tibetm ini-p igs.It has been confirm ed that there is a certain genetic d ifferentiation in the Tibet m ini-p ig.

Tibetm ini-p ig;Cyt b gene;Comparative research

R332

A

1005-4847(2010)01-0044-04

2009-06-04

广东省科研计划项目(编号:2006B60101059,2007B020706002)。

李洪涛(1964-),男,研究方向:比较医学。E-mail:Hongtao@zzu.edu.cn

顾为望。E-m ail:Guww100@163.com