水迷宫实验中三种品系小鼠学习记忆能力的比较

薛丹，徐淑萍，刘进修，，刘新民，李澎涛，刘华钢

(1.中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京 100193;2.北京中医药大学，北京 100029; 3.广西中医学院，广西南宁 530001)

研究报告

水迷宫实验中三种品系小鼠学习记忆能力的比较

薛丹1，2，徐淑萍1，刘进修1，3，刘新民1，李澎涛2，刘华钢3

(1.中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京 100193;2.北京中医药大学，北京 100029; 3.广西中医学院，广西南宁 530001)

目的探讨三种品系小鼠在Morris水迷宫实验中的学习记忆能力差异，为与改善学习记忆能力相关新药研究的实验动物选择提供参考。方法选用C57BL/6小鼠、昆明种小鼠和ICR小鼠，进行定位航行实验(5 d)、空间搜索实验(1 d)和工作记忆实验(4 d)，考察其学习记忆能力。结果定位航行实验从第3天起C57BL/6小鼠的潜伏期明显小于昆明种小鼠和ICR小鼠(P＜0.01);空间搜索实验C57BL/6小鼠穿过原平台位置的次数、在原平台象限游程比率和时间比率均明显多于昆明种小鼠和ICR小鼠(P＜0.05);动物每天工作记忆实验的潜伏期随测试次数增加而缩短，C57BL/6小鼠缩短的较昆明种小鼠和ICR小鼠稍多。结论C57BL/6小鼠的空间参考记忆能力与工作记忆能力均优于昆明种小鼠和ICR小鼠，且非空间因素对其学习记忆能力的评价干扰较小，可作为优先选择的水迷宫实验动物。

品系差异;水迷宫;参考记忆;工作记忆

Morris水迷宫实验［1］(Morris water maze test)是一种评价空间学习记忆能力的经典方法，在二十多年来的广泛应用中实验方法不断改进及创新［2－5］，实验对象也从最初的大鼠扩展到小鼠、人类(虚拟迷宫［6］)。对于使用最多的大鼠、小鼠不同品系间的水迷宫学习记忆能力的比较已有报道［4;7］，但都只考察了空间参考记忆能力，主要采用经典的定位航行实验和空间搜索实验方法［8］，对于近年来逐渐发展的工作记忆［3;9］方面却并未涉及。本实验采用常用的C57BL/6小鼠、昆明种小鼠和ICR小鼠，除比较它们在Morris水迷宫实验中参考记忆能力的差异外，还通过工作记忆实验［2］考察三种小鼠的工作记忆能力，以期为水迷宫实验动物的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

C57BL/6小鼠和ICR小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2006－0009】，昆明种小鼠(KM)，购自中国医学科学院实验动物研究所【SCXK(京)2004－0001】，3种小鼠均为雄性，健康，购入时为6周龄，适应性饲养12 d后进行Morris水迷宫实验。

分组:①C57BL/6小鼠30只，实验前1天体质量19～24 g;②KM小鼠31只，实验前1天体质量34～40 g;③ICR小鼠30只，实验前1天体质量30～35 g。实验室安静，自然采光，动物分笼饲养，自由饮食。

1.2 实验仪器

小鼠Morris水迷宫在线检测系统由中国医学科学院药用植物研究所、中国航天员科研训练中心、北京三维拓盟数字影像技术有限公司在本实验室原有仪器［10］基础上进一步开发，由一个不锈钢喷塑圆柱形水池和图像采集分析系统两部分组成。水池直径为100 cm，高38 cm。平台直径6 cm，高14 cm。按东南西北四个方向将水池平均划分为4个象限(NE、SE、SW、NW)，象限池壁圆弧中点为可选的动物入水点，平台可置于任意一个象限的中央。图像采集分析系统记录动物游泳轨迹数据，用于指标的提取及分析。

1.3 实验方法

1.3.1 定位航行实验(place navigation):历时5 d，实验前1天不放置平台，让小鼠自由游泳2 min。正式实验时将平台固定在SE象限，位于水面下1.5 cm，水温稳定在(25±0.5)℃。实验室中的物品和人员的位置在实验期间固定不变，作为动物的空间参照物。每天测试4次，每次从不同的入水点将动物面向池壁放入水中(入水点顺序以半随机的方法安排，以免动物按向左或向右的方法去定位［5］，同一次测试中所有动物的入水点相同)，检测时间为60 s，在平台上停留超过2 s则判为寻台成功，将动物从入水到寻台成功所需的时间记作逃避潜伏期，若60 s内未找到平台则潜伏期记为60 s。每次测试前先将动物置于平台上停留15 s(称为适应)，测试完毕不论寻台是否成功均适应10 s。计算每天潜伏期平均值，以评价动物空间记忆的获得能力。

1.3.2 空间搜索实验(spatial probe):定位航行实验结束次日，拆除平台，选择NW象限作为入水象限，通过动物在60 s内穿过原平台位置的次数、原平台象限游程比率及时间比率(即动物在原平台象限的游程及时间占总游程及总时间的比率)来评价动物的空间记忆能力。

1.3.3 工作记忆实验(spatial working memory):空间搜索实验结束次日开始，历时4 d，每天变换一次平台的位置(依次位于SW、NE、NW、SE象限)，测试前不予适应，测试后适应5 s，其余实验过程同定位航行实验。以每次测试的潜伏期来评价动物的工作记忆能力。

1.4 统计学处理方法

2 结果

2.1 定位航行实验

注:**P＜0.01，***P＜0.001，与C57BL/6小鼠比较。图1三种品系小鼠水迷宫实验结果(定位航行) Note:**P＜0.01 and***P＜0.001，compared with C57BL/6 miceFig.1 Results of Morris water maze(place navigation)test in the three species of m ice

三种品系小鼠的潜伏期随训练天数增加而逐渐缩短，前5d的总体学习成绩的组间差异有统计学意义(F=15.968，P＜0.001)。两两比较结果显示，自第3天起，C57BL/6小鼠的潜伏期明显短于KM和ICR小鼠(P＜0.01);而KM和ICR小鼠之间则无明显差异(图1)。进一步对组内各时间点的潜伏期进行两两比较，结果显示，三种品系小鼠第1～3天潜伏期之间的差异均有统计学意义(P＜0.05)，而第4、5天潜伏期之间差异无显著性，提示其学习成绩已基本稳定。

2.2 空间搜索实验

三个品系小鼠穿越原平台位置的次数、原平台象限游程比率和时间比率上的差异有统计学意义(F=3.218，P＜0.001)。C57BL/6小鼠的穿台次数较KM和ICR两组多(P＜0.05)，且原平台象限游程比率和时间比率明显高于其他两组，差异有显著性(P＜0.001)，而KM、ICR小鼠之间上述三种指标均无明显差异(表1)，提示C57BL/6小鼠对原平台的空间位置记忆能力比KM和ICR小鼠强。

表1 三种品系小鼠水迷宫实验结果(空间搜索)(±s)Tab.1 Results of Morris water maze test(spatial probe)in the three species of mice(±s)

表1 三种品系小鼠水迷宫实验结果(空间搜索)(±s)Tab.1 Results of Morris water maze test(spatial probe)in the three species of mice(±s)

注:*P＜0.05，***P＜0.001，与C57BL/6小鼠比较差异有显著性。Note:*P＜0.05 and***P＜0.001，compared with C57BL/6 mice.

组别Group数量n穿越原平台次数Number of crossings in target quadrant原平台象限时间比率(%) Percent time in target quadrant原平台象限游程比率(%) Percent distance in target quadrant C57BL/6 30 3.66±0.45 47.1±2.2 46.1±2.1 KM 31 2.03±0.23*31.8±2.0***33.1±2.0***ICR 30 2.07±0.29*29.2±1.9***30.5±1.8***

2.3 工作记忆实验

三种品系小鼠前3 d的潜伏期并未随训练天数增加而缩短，而在第4天它们的潜伏期均明显缩短，考虑与平台位置同定位航行实验中一致有关。如图2所示，各组每天的潜伏期都有随测试次数增加而缩短的趋势，而C57BL/6小鼠缩短的较其他两种小鼠稍多。同时观察到，每天各组的平台所在象限游程比率、时间比率随测试次数有增加的趋势，C57BL/6小鼠与其他两种小鼠间的差异有统计学意义(P＜0.05，具体数据未附上)。

注:a、b、c、d工作记忆实验第1至4天的潜伏期。*P＜0.05，**P＜0.01，与C57BL/6组比较差异有显著性。图2三种品系小鼠水迷宫实验结果(工作记忆)Note:a，b，c，d:Latency from the 1stto the 4thday in the working memory test.*P＜0.05 and**P＜0.01，compare with C57BL/6 mice.Fig.2 Results of Morris water maze test(working memory)in the three species of mice

3 讨论

参考记忆存储固定不变的信息，可由反复训练获得，并可保持几天到几个月。定位航行实验和空间搜索实验均基于参考记忆，前者考察动物的空间学习获得能力，后者考察其空间记忆保持能力［12］。本次实验发现在参考记忆能力方面，C57BL/6小鼠表现较好，这与已有的研究结果相一致［4;7］。在定位航行实验中，三种品系小鼠自第4天起潜伏期已基本稳定，提示与本实验相同周龄、品系的小鼠若采用本实验方法可考虑训练4d。在空间搜索实验中，除经典的评价指标穿台次数外，我们同时采用了原平台象限时间比率和游程比率两个指标，发现这两个指标C57BL/6小鼠与其他两种小鼠的差异更加明显，提示在区别不同品系小鼠的参考记忆能力的差异方面，这两个指标可能较穿台次数更加敏感。

与参考记忆不同，工作记忆具有暂存性，对复杂的认知工作(如语言理解、学习和推理)所必需的信息进行临时存储和处理［13］，其容量有限，为了在正确的时间使用正确的信息，需忽略以前的相关信息。工作记忆实验中，平台的位置每天变换，当天第一次测试中动物需对新平台位置进行临时存储，并将此信息用于随后的三次测试。本实验中，我们观察到前3 d尽管平台已不在SE象限，第一次测试时三个品系的小鼠几乎都会先在SE象限寻找平台，之后有一部分会去前日平台所在象限寻找，这个现象在C57BL/6小鼠上尤为明显。一旦寻台成功，在当日随后的测试中C57BL/6小鼠都能较快的找到平台。第4天三个品系小鼠的潜伏期明显短于前3 d，考虑与之前定位航行实验中形成的参考记忆有关(平台位置相同)。从实验结果可以看出，C57BL/6小鼠的工作记忆能力较KM小鼠和ICR小鼠稍强。

参考记忆与工作记忆属于两种不同的记忆系统。二者的损害未必会同步发生，如Frick等［9］研究发现，与4月龄Fischer－344的大鼠相比，11、17、24月龄大鼠均有参考记忆能力的损害，而只有24月龄大鼠出现工作记忆能力的损害。本次实验发现，不同品系小鼠在参考记忆和工作记忆上的差异大小不等，它们在工作记忆上的差异要小于参考记忆的差异。

同时我们在实验中观察到部分KM小鼠与ICR小鼠有时会出现漂浮不动及攀爬的情况，且多位于池壁附近，随着测试次数的增加而有所减少。而C57BL/6小鼠则极少出现漂浮不动及攀爬的情况，这可能是由于它们对水迷宫的应激反应不同引起［7］。这种非空间因素在一定程度上影响了对其学习记忆能力的判断。

综上所述，C57BL/6小鼠、KM小鼠和ICR小鼠都能完成Morris水迷宫的定位航行实验、空间搜索实验和工作记忆实验。在Morris水迷宫实验中可优先考虑选用综合表现良好的C57BL/6小鼠，若选用其他两种小鼠，则可在实验初先采用线索学习、非空间预训练等方法对非空间因素的干扰进行控制［5］，再继续进行学习记忆能力的检测。

［1］Morris R.Spatial localization does not require the presence of local cues［J］.Learn Motiv，1981，12(2):239－260.

［2］Morris R.Developments of a water－maze procedure for studying spatial learning in the rat［J］.J Neurosci Methods，1984，11 (1):47－60.

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［13］Baddeley A.Working memory［J］.Science，1992，255:556－559.

Com parison of Learning and M em ory Abilities am ong Three Species of M ice Tested in M orris W ater M aze

XUE Dan1，2，XU Shu－ping1，LIU Jin－xiu1，3，LIU Xin－min1，LI Peng－tao2，LIU Hua－gang3
(1.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，
Beijing 100193，China; 2.Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100029;3.Guangxi Traditional Chinese Medical University，Nanning 530001)

ObjectiveTo investigate the differences of learning and memory abilities among three species of mice tested in Morris water maze.M ethods Place navigation，spatial probe and working memory tests were performed to determine the learning and memory abilities of C57BL/6，Kunming and ICR mice.ResultsC57BL/6 mice found the hidden platform faster than other two strains of mice in the place navigation test，showing a significant difference from the 3rdday(P＜0.01).In the spatial probe test，C57BL/6 mice spent more time in the target quadrant than other groups(P＜0.001).In working memory test，the escape latency of mice became shorter and shorter in four tests per day，and C57BL/6 m ice saved more time to the platform than Kunm ing m ice and ICR mice，but there was no significant difference between Kunm ing mice and ICR mice.Conlusions C57BL/6 mice perform better than Kunming mice and ICR m ice in spatial reference and working memory abilities.It may be more suitable for Morris water maze test.

Strain differences;Morris water maze;Reference memory;Working memory;M ice

R－33

A

1005－4847(2010)02－0149－04

2009－11－02

国家科技支撑计划(2006BAI08B05－07);国家科技重大专项(2009ZX09502－014)。

薛丹(1983－)，女，博士生，研究方向:中药神经药理。E－mail:xuedanxy@126.com

刘新民，博士生导师，E－mail:Liuxinmin@hotmail.com;李澎涛，博士生导师，E－mail:Lipengtao0413@hotmail.com