低剂量双酚A灌胃对去卵巢小鼠子宫的增生作用

吴建辉，杨荣富，徐滢雯，王玖玖，刘向云，刘桂明，何桂林，孙祖越

(1.复旦大学，上海200433;

2.中国生育调节药物毒理检测中心，上海市计划生育科学研究所药理毒理学研究室，上海 200032)

研究报告

低剂量双酚A灌胃对去卵巢小鼠子宫的增生作用

吴建辉1，2，杨荣富2，徐滢雯2，王玖玖2，刘向云2，刘桂明2，何桂林2，孙祖越2

(1.复旦大学，上海200433;

2.中国生育调节药物毒理检测中心，上海市计划生育科学研究所药理毒理学研究室，上海 200032)

目的观察小鼠经消化道途径给予低剂量环境内分泌干扰物双酚A对子宫的作用及机制。方法雌性ICR小鼠切除双侧卵巢，恢复性饲养1周，剔除异常个体后，50只动物随机分成5组，每组10只动物，依次皮下注射(sc)10.0 μg/(kg·d)17β－雌二醇，灌胃(ig)0、20.0、60.0和180.0 μg/(kg·d)BPA，连续7 d。动物每3d称量体重一次，于最后一次给药24 h后，阴道涂片检测角化上皮细胞，颈椎脱臼处死动物，取子宫，称其干湿重，计算子宫脏器指数，组织切片，HE染色后利用图像分析系统测量子宫上皮高度和宫腔面积。免疫组化法分析子宫雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)表达。结果①与对照组相比，雌二醇和BPA低剂量组动物体重增加，BPA中高剂量组动物体重无明显差异。②阴道涂片结果显示，处于动情期动物数分别为:对照组0/10，雌二醇组10/10，BPA低剂量组2/10，BPA中剂量组1/10，BPA高剂量组0/10;③BPA低剂量组动物子宫湿重和含水量较对照组增加，脏器系数增大，BPA中高剂量组子宫湿重和脏器系数较对照组降低明显(P＜0.05);④病理组织学及显微图像分析结果显示，BPA低剂量组动物子宫腔面积较对照组增大，中高剂量组子宫腔面积明显减小(P＜0.01);低剂量组动物子宫上皮高度较对照组增高(P＜0.01)，中高剂量组子宫上皮高度降低明显(P＜0.01)。⑤免疫组化结果显示，低剂量BPA能增强小鼠子宫ER和PR表达，但随剂量增加，ER表达下降。结论BPA经消化道途径给予ICR小鼠，人环境暴露剂量下具有雌激素活性，但雌激素活性随BPA剂量增大呈现下降趋势。

双酚A(BPA);雌激素活性;子宫;小鼠

双酚A(BPA)是制造聚碳酸脂、环氧树脂等的前体物，广泛应用于食品包装、饮料容器等日常生活塑料制品的生产，可通过食品包装容器或塑料薄膜渗入食品或饮料进入人体。其化学结构与雌激素类似，认为具有弱的雌激素活性，系环境雌激素的一种［1］。目前对BPA是否具有胚胎毒性还存在争议，但一些动物实验已证示BPA对雄性生殖系统具有直接毒性作用，实验结果尤其提示环境暴露剂量下，BPA可能对男性生殖系统存在较为明显毒性作用［2－4］。综合目前已公开报道的有关BPA雌激素活性的文献，BPA的给予方式主要包括:体外直接作用于细胞;皮下注射大剂量给予动物［5］;或整体大剂量给予动物，最高剂量达800 mg/kg［6］，结论均认为BPA雌激素活性随剂量增加而增强。日常生活中，人体主要通过消化道途径接触BPA，环境暴露BPA的剂量为1 μg/kg［7］。在这种低剂量暴露情况下，BPA的雌激素活性如何?是否也呈现出剂量效应关系?目前尚无文献对BPA低剂量状态的雌激素活性进行探讨。新近的研究报道提示，低剂量的BPA具有雄性生殖毒性，尤其表现为对前列腺的影响，这种毒性表现是否与低剂量BPA异常雌激素活性有关?本文旨在探讨模拟人体环境暴露途径情况下，低剂量BPA的雌激素活性及原因，为进一步探讨BPA与前列腺增生关系研究提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 动物

ICR雌性小鼠，体重18～20 g，购自斯莱克实验动物有限责任公司［SCXK(沪)2007－0005］。

1.2 药物

双酚A(bisphenol A)，含量95%，批号162k0715，Sigma公司生产，以0.5%的羧甲基纤维素钠(CMC)均匀分散供试品;17β－雌二醇(17βestradiol)，含量97%，批号23607072，Sigma公司生产，橄榄油溶解。

1.3 仪器

PM 600型电子天平，Switzerland产;BH－2型显微镜，日本Olympus公司;Motic Images Advanced 3.2显微图像分析软件，Motic中国有限公司。

1.4 动物处理及给药

动物适应性饲养3d后，麻醉状态下切除双侧卵巢，恢复性饲养1周，连续5 d作阴道涂片，剔除出现动情反应的个体。符合要求的动物按体重随机分为5组，依次分设对照组、雌二醇组和BPA低、中、高三个剂量组，每组10只动物。雌二醇组动物皮下注射10.0 μg/(kg·d)17β－雌二醇，BPA组动物依次灌胃给予20.0、60.0和180.0 μg/(kg·d)BPA，连续7 d，对照组动物灌胃给予等体积溶媒。动物每3d称量体重一次，于最后一次给药24 h后，阴道涂片检测角化上皮细胞，染色拍照，颈椎脱臼处死动物。

1.5 子宫病理组织学观察及上皮高度与子宫腔面积分析

取子宫，修去子宫周围脂肪，称其湿重，计算子宫脏器系数，其中一半子宫组织置80℃干燥24h后，称量干重，另一半子宫组织置10%福尔马林溶液固定，病理切片，HE染色后，光学显微镜下观察子宫形态学变化，并利用图像分析系统测量子宫内膜上皮高度和子宫腔面积。

1.6 免疫组织化学法检测子宫雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)表达

子宫组织经10%中性福尔马林液固定后，石蜡包埋，4 μm切片，按武汉博士德生物工程有限公司提供的试剂盒使用说明，SABC免疫组化法检测子宫组织ER和PR受体表达，其中，ER和PR抗体按1∶100稀释。每组选6个标本，每张组织切片观察5个视野，利用图像分析软件分析平均吸光度值，分析ER和PR的表达程度。

1.7 统计方法

借助SPSS11.5统计软件，根据数据性质进行相关分析，计量资料采用均值±标准差表示，进行方差分析检验后，再进行组间两两比较。

2 结果

2.1 给予BPA后ICR小鼠体重变化

去势ICR小鼠恢复性饲养一周后，灌胃给予BPA，各组动物平均体重均呈增长趋势，其中，雌二醇组动物体重增长最为明显，至给药后第8天，BPA低剂量组动物平均体重高于中高剂量BPA组和对照组，BPA中剂量组动物平均体重略低于对照组(图1)。

2.2 BPA对ICR小鼠动情周期影响

ICR小鼠给予BPA 7 d后，阴道涂片经Giemsa染色，显微镜下观察显示，处于动情期的ICR小鼠数量随BPA剂量增加而减少，雌二醇组动物均处于动情期，对照组动物多数处于动情后期和动情间期(表1)。

图1 BPA对去势ICR雌性小鼠体重影响Fig.1 Effects of BPA on the body weight of ovariectomized female ICR mice

表1 BPA对去势ICR小鼠动情周期影响(n=10)Tab.1 Effects of BPA on estrous cycle of ovariectomized ICR m ice(n=10)

2.3 BPA对ICR小鼠子宫重量及含水量影响

ICR小鼠给予BPA后，低剂量组动物子宫平均重量和组织平均含水量增加，脏器系数增大，与雌二醇组相当。随BPA剂量增加，动物子宫重量和子宫脏器系数降低(P＜0.05)，子宫组织平均含水量降低(表2)。

表2 BPA对去势ICR小鼠子宫重量及含水量影响(x±s，n=10)Tab.2 Effects of BPA on the uterus weight and water content in the ovriectom ized ICR mice(±s，n=10)

表2 BPA对去势ICR小鼠子宫重量及含水量影响(x±s，n=10)Tab.2 Effects of BPA on the uterus weight and water content in the ovriectom ized ICR mice(±s，n=10)

注:*P＜0.05，**P＜0.01 vs.对照组Note:*P＜0.05，**P＜0.01 compared with the control group.

组别Group体重(g) Body weight子宫重量(g) Uterus weight含水量(/100) Uterus water content(/100)脏器系数(/100) Organ coefficient(/100)对照组Control group 27.5±2.4 0.11±0.02 79.9±5.7 0.41±0.10雌二醇组E2 group 31.2±1.5**0.18±0.03**81.0±3.1 0.59±0.11**BPA低剂量20 μg/kg BPA 28.5±2.2 0.15±0.04 80.9±2.6 0.52±0.15 BPA中剂量60 μg/kg BPA 27.2±3.0 0.07±0.04*58.9±13.1*0.26±0.13*BPA高剂量180 μg/kg BPA 27.7±2.1 0.08±0.01*74.7±11.4 0.28±0.05*

2.4 BPA对ICR小鼠子宫形态学影响

去势ICR小鼠给予BPA 7 d后，BPA低剂量组动物子宫腔面积增大，子宫上皮增生明显(P＜0.01)，而BPA高剂量组动物子宫腔面积缩小(P＜0.01)，子宫上皮萎缩。镜下显示，BPA低剂量组子宫腔内上皮增生突出，随BPA剂量增加，子宫腔面积缩小，子宫上皮萎缩。见表3，图2(见彩插9)。

表3 BPA对去势ICR小鼠子宫腔及子宫上皮高度影响(±s)Tab.3 Effects of BPA on the uterine luminal surface area and the height of endometrial epithelium in the ovariectom ized ICR mice(±s)

表3 BPA对去势ICR小鼠子宫腔及子宫上皮高度影响(±s)Tab.3 Effects of BPA on the uterine luminal surface area and the height of endometrial epithelium in the ovariectom ized ICR mice(±s)

注:*P＜0.05，**P＜0.01 vs.对照组Note:*P＜0.05，**P＜0.01，compared with the control group.

组别Group子宫腔面积Area of Uterine cavity (n=10，μm2)子宫上皮Height of Endometrium (μm，n=50)对照组Control group 20 224±6 395 3.35±0.77雌二醇组E2 group 17 569±5 856 5.65±0.78**BPA低剂量20 μg/kg BPA 23 004±7 668 4.85±0.77**BPA中剂量60 μg/kg BPA 4 091±1 446**2.63±0.77 BPA高剂量180 μg/kg BPA 735±245**1.97±0.48**

2.5 BPA对ICR小鼠子宫雌、孕激素受体(ER、PR)表达的影响

免疫组化结果显示，给予BPA后，ICR小鼠子宫ER表达有一定程度增加，但随剂量增加下降。PR表达较对照组增加明显，以低剂量组最为明显。见表4，图3、4(见彩插10)。

表4 BPA对ICR小鼠子宫雌、孕激素受体(ER、PR)表达的影响((x±s，n=6)Tab.4 Effects of BPA on the expression of ER and PR in the ovariectomized ICR m ice(x±s，n=6)

3 讨论

良性前列腺增生症(BPH)是一种多发于中老年男性的常见疾病，并随着年龄增大发病率升高。BPH病因复杂，其中雌激素介入BPH的发病过程，而且低剂量的雌激素能够促进BPH发生［8，9］。BPA作为一种环境内分泌干扰物，经体内代谢转化后，其雌激素活性增高［10］。由于BPA雌激素活性的存在，无法排除其与BPH存在一定联系。

本次研究中，去势ICR小鼠灌胃给予20 μg/ (kg·d)BPA一周，7/10的动物处于动情期和动情后期，动物平均体重高于对照组，并且动物子宫平均重量和含水量增加，子宫脏器系数增大。镜下观察结果显示，低剂量BPA组动物子宫腔面积增大，子宫上皮增生明显。但随着BPA剂量的逐步增大，其增生作用逐渐减弱。研究表明20 μg/(kg·d)的BPA在生物体内具有雌激素活性，并且在三个实验剂量组中，雌激素活性最强。根据免疫组化结果，20 μg/(kg·d)BPA组动物子宫ER和PR受体表达增高，当BPA剂量增大至9倍后，小鼠子宫组织ER的表达低于对照组。

BPA能够与ER受体结合，进而诱导激活雌激素反应相关基因，产生雌激素活性［11］。小鼠暴露于20 μg/(kg·d)BPA(低于人类孕妇的暴露水平)，其雌激素活性的增强可能通过诱导ER和PR表达增加而达到。由于BPA能够与雄激素亚型受体结合［12］，随着BPA剂量增加，雄激素活性的表达增强，在一定程度上可能削弱雌激素对子宫的增生作用，从而导致子宫随BPA剂量增加而呈萎缩趋势。至于其具体通过何种机制导致雌激素活性随BPA剂量增加而降低，需要进一步探讨。

(本文图2见彩插9，图3、4见彩插10)。

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Proliferative Effect of Intragastrically Adm inistered Low Dose Bisphenol A on the Uterus in Ovariectom ized M ice

WU Jian－hui1，2，YANG Rong－fu2，XU Yin－wen2，WANG Jiu－jiu2，LIU Xiang－yun2，LIU Gui－m ing2，HE Gui－lin2，SUN Zu－yue2
(1.Fudan university，Shanghai 200433，China. 2.Department of Pharmacology and Toxicology of Shanghai Institute of Planned Parenthood Research. National Evaluation Center for the Toxicology of Fertility Regulation Drugs，Shanghai 200032)

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of low dose bisphenol A(BPA)，a xenoestrogen，given by gastric lavage，on uterus of female mice.M ethods Ovariectomized female ICR mice were bred for one week observation and excluding unqualified animals.50 mice were random ly divided into 5 groups，10 animals per group.The m ice were administered 10.0 μg/(kg.d)17β－estradiol(E2)by subcutaneous injection and 0，20.0，60.0 or 180.0 μg/ (kg.d)BPA via intragastric gavage for 7 days.The body weight was monitored every 3 days，vaginal smears were examined by cytology，and the animals were killed at 24 hours after the last treatment.The uterus was removed to measure the wet weight，water content，and to calculate the organ coefficient.The height of endometrial epithelial cells and luminalarea were analyzed with a micro－image analysis system(M IVNT).The expression of estrogen receptor(ER)and progesterone receptor(PR)of uterus were analyzed by immunohistochemistry.Results①Compared with the control，the mean animal body weights of mice of the E2group and low dose BPA group were increased，while there were no significiant differences between mid and high dose BPA groups and control.②Based on cytological data of vaginal smear，animal number in estrus were:0/10 in control group，10/10 in E2 group，2/10 in low－dose BPA group，1/10 in mid－dose BPA group，and 0/10 in high－dose BPA group.③Compared with the control group，the uterus weight，water content and organ coefficient in the low－dose BPA group were increased，while those of mid－and high－dose BPA groups were significantly decreased(P＜0.05).④According to the data of histopathology and MIVNT，compared with the control，the uterine luminal area in the low－dose BPA group was significantly enlarged，and the height of endometrial epithelial cells was increased(P＜0.01)，while in the mid－and high－dose BPA groups，the luminal area was decreased(P＜0.01)，and the height of endometrial epithelial cells was decreased(P＜0.01).⑤The immunohistochemical data showed that compared with the control group，the ER and PR expressions in the low－dose BPA group were increased，while in the m id－and highdose BPA groups，the expression of ER was decreased，but there were no significant differences.ConlusionA per os intake of BPA at a dose of 20 μg/(kg.d)，a dosage below human daily intake，may promote uterine proliferation in female m ice.But this estrogenic activity is decreasing alone with an increasing dose of BPA.

Bisphenol A(BPA)，Estrogenic activity，Uterus，Mice，female

R994.6

A

1005－4847(2010)02－0145－04

2009－08－05

上海市科委“创新行动计划”实验动物研究项目(编号:09140900500)。

吴建辉(1976－)，男，助理研究员，博士研究生，研究方向:男性生殖健康及前列腺疾病治疗药物药理毒理学研究。Tel:021－64438949，E－mail:wwjh_731@yahoo.com.cn。

孙祖越，E－mail:sunzy64@163.com.